OMAIAC159/2006
ID intern unic:  321134
Версия на русском
Fişa actului juridic

Republica Moldova
MINISTERUL AGRICULTURII ŞI INDUSTRIEI ALIMENTARE
ORDIN Nr. 159
din  07.07.2006
cu privire la aprobarea Normei sanitare veterinare privind stabilirea unor
metode de analiză şi testare a laptelui materie primă şi celui tratat termic
Publicat : 23.02.2007 în Monitorul Oficial Nr. 025     art Nr : 114
În conformitate cu prevederile Legii nr.1538-XII din 23.06.1993 privind activitatea veterinară, în scopul ocrotirii sănătăţii omului, protecţiei intereselor consumatorului, şi în scopul armonizării legislaţiei veterinare a Republicii Moldova cu cea a Comunităţii Europene,
ORDON:
1. Se aprobă "Norma sanitară veterinară  privind stabilirea unor metode  de analiză şi testare a laptelui materie primă şi celui tratat termic", armonizată cu prevederile Directivei Consiliului Europei 91/180/CEE din 14. 02. 1991 în domeniul nominalizat ( se anexează).
2. Direcţia   Medicină Veterinară, Inspectoratul Veterinar de Stat, Centrul Republican de Diagnostic Veterinar, serviciile sanitare veterinare de stat raionale şi municipale se vor conduce în activitatea lor după prevederile prezentei Norme sanitare veterinare.
3. Prezentul ordin va intra în vigoare din momentul  publicării în Monitorul Oficial al Republicii Moldova.
4. Se abrogă Ordinul Ministerului Agriculturii si Industriei Alimentare nr. 162 din 30.06.2005 "Cu privire la aprobarea Normei sanitare veterinare privind stabilirea unor metode  de analiză şi testare a laptelui materie primă şi celui tratat termic".
5. Controlul asupra executării prezentului ordin îl exercită Direcţia  Medicină Veterinară, Inspectoratul Veterinar de Stat.
MINISTERUL AGRICULTURII ŞI
INDUSTRIEI ALIMENTARE              Anatolie GORODENCO
Nr. 159. Chişinău, 7 iulie 2006.
Anexă
la ordinul Ministerului Agriculturii
şi Industriei Alimentare
nr. 159 din 7 iulie 2006
NORMA SANITARĂ VETERINARĂ
PRIVIND STABILIREA UNOR METODE DE ANALIZĂ Şl TESTARE
A LAPTELUI MATERIE PRIMĂ ŞI A CELUI TRATAT TERMIC
1. Procedeele de referinţă folosite pentru  analiza şi  testarea laptelui  materie primă sînt următoarele:
a) determinarea punctului de congelare a laptelui;
b) numărarea microorganismelor din lapte prin metoda numărării  coloniilor obţinute la 30oC;
c) numărarea celulelor somatice din laptele crud;
d) detectarea antibioticelor şi sulfamidelor.  
2. Procedeele de referinţă folosite pentru analiza şi testarea laptelui pasteurizat sînt următoarele:
a) determinarea punctului de congelare;
b) numărarea microorganismelor din lapte prin metoda numărării  coloniilor obţinute la 30oC;
c) numărarea microorganismelor din lapte prin metoda numărării  coloniilor obţinute la 21oC;
d) determinarea activismului fosfatazei;
e) determinarea activismului peroxidazei;
f) determinarea  cantităţii de coliformi din laptele pasteurizat prin metoda numărării  coloniilor obţinute la 30oC;
g) detectarea antibioticelor şi sulfamidelor.
3. Procedeele de referinţă folosite pentru analiza şi testarea laptelui UHT sînt următoarele:
a) determinarea punctului de congelare;
b) numărătoarea microorganismelor din lapte prin metoda de numărare a coloniilor obţinute la 30oC;
c) detectarea antibioticelor şi sulfamidelor.
4. Analiza şi testarea laptelui prin procedeele de referinţă se efectuează pe eşantioane recoltate, conform regulilor descrise în Anexa nr.1 la prezenta Normă sanitară veterinară.
5. Procedeele enumerate la punctele 1, 2 şi 3 sînt descrise în Anexa nr. 2 la prezenta Normă sanitară veterinară.
Anexa  nr. 1
la Norma sanitară veterinară
privind  stabilirea unor metode
de analiză şi de testare a laptelui
crud şi a laptelui tratat termic.
METODE PENTRU
EŞANTIONAREA LAPTELUI CRUD ŞI A LAPTELUI TRATAT TERMIC
1. Obiect şi domeniu de aplicare
Procedeul de eşantionare a laptelui crud şi a laptelui tratat termic în vederea efectuării examenelor de laborator constituie metoda de referinţă.
Procedeul se aplică laptelui crud livrat de producători, precum şi laptelui crud şi laptelui tratat termic din cuvele de păstrare, celui din cisternele de transport şi laptelui tratat termic, destinat consumului direct şi condiţionat pentru vînzarea cu amănuntul.
2. Consideraţii de ordin general
Eşantionarea laptelui crud şi laptelui tratat termic conţinut în bidoane, cisterne etc. trebuie să fie efectuată de o persoană autorizată cu o pregătire de calificare a laboratorului abilitat.
Autorităţile competente sau laboratorul de analize vor instrui personalul care efectuează eşantionarea asupra modului de eşantionare şi marcare pentru a fi sigur că eşantionul este reprezentativ şi conform cu ansamblul lotului.
3. Echipamentul destinat eşantionării
3.1. Generalităţi.
Echipamentul pentru eşantionare trebuie să fie fabricat din oţel inoxidabil sau din orice alt material adecvat, care să aibă rezistenţa necesară şi să fie construit în funcţie de utilitatea acestuia (amestecare, eşantionare etc.).
Plonjoarele şi agitatoarele destinate amestecării lichidelor din recipiente trebuie să aibă o  suprafaţă suficientă pentru a permite o amestecare corespunzătoare a produsului fără a admite apariţia gustului de rînced. Polonicurile trebuie să fie prevăzute cu un braţ solid, suficient de lung pentru prelevarea eşantioanelor din orice profunzime a recipientului. Capacitatea polonicului trebuie să fie de minim 50 ml. Recipientele pentru eşantioane ca şi capacele lor trebuie să fie de sticlă, metal sau plastic adecvat.
Aliajele folosite la confecţionarea sondelor pentru prelevarea probelor nu trebuie să comporte nici o modificare a eşantionului, susceptibilă să influenţeze rezultatele analizelor. Materialele şi recipientele destinate eşantioanelor trebuie să aibă o suprafaţă curată, uscată, netedă, cu unghiuri rotungite.
3.2. Materialul de eşantionare pentru analiza microbiologică.
Materialul de eşantionare (inclusiv recipientele) trebuie să respecte dispoziţiile punctului 3.1. şi să fie steril. Cînd acelaşi material serveşte la mai multe eşantionări, el trebuie spălat şi sterilizat după fiecare eşantionare conform instrucţiunilor sau exigenţelor laboratorului de analize sau ale autorităţii competente, astfel încît să nu influenţeze rezultatele diferitelor analize succesive.
4. Eşantionarea
4.1. Generalităţi.
Indiferent de scopul  analizei, înainte de prelevare, laptele trebuie amestecat corespunzător printr-un mijloc manual sau mecanic. Eşantionul trebuie prelevat imediat după amestecare, cînd laptele este încă în mişcare. Cînd se prelevează simultan mai multe eşantioane de lapte dintr-o cisternă pentru diferite testări, eşantionul destinat analizei microbiologice trebuie să fie prelevat primul.
Volumul eşantionului trebuie să fie în funcţie de necesarul pentru analiză. Capacitatea recipientelor folosite trebuie să fie astfel încît să fie umplută aproape complet de eşantion, permiţînd o bună amestecare a conţinutului înainte de analiză, şi evitîndu-se baterea în timpul transportului.
4.2. Eşantionare manuală.    
4.2. l. Prelevarea din găleţi şi bidoane cu lapte.
Pentru obţinerea rapidă a agitaţiei dorită polonicul se mişcă de sus în jos în găleată sau în bidon, cu atenţie ca laptele să fie bine amestecat şi smîntîna să nu adere de gîtul bidonului. Prelevarea  eşantionului se efectuează conform punctului 4.2.4.
4.2.2. Prelevarea din cuva de refrigerare din fermă.
Laptele se agită mecanic sau manual pînă la obţinerea unei omogenizări suficiente. Dacă volumul laptelui nu permite folosirea unui agitator mecanic, se agită manual.
4.2.3. Prelevarea din cuva de măsurare.
Este esenţial ca laptele să fie bine amestecat cînd se varsă în cuva de măsurare. Pentru obţinerea  unei repartiţii omogene a materiei grase se poate completa amestecarea printr-o agitaţie mecanică sau manuală. Cînd volumul lotului de eşantionat depăşeşte capacitatea cuvei de măsurare, se prelevă un eşantion reprezentativ din întreg lotul,  conform punct. 4.2.4.
4.2.4. Eşantionarea unui lot divizat.
Cînd cantitatea de lapte eşantionat este  repartizată în mai multe recipiente, se prelevă o  cantitate reprezentativă din fiecare recipient şi se notează din ce cantitate de lapte s-a prelevat  fiecare eşantion. Numai în cazul în care eşantioanele ce provin din fiecare recipient nu trebuie să fie supuse analizelor separate, se amestecă porţiuni din aceste cantităţi reprezentative, proporţional cu cantitatea  aflată în recipientul din care s-a recoltat fiecare eşantion. După amestecare, se prelevă unul sau mai multe eşantioane din aceste cantităţi proporţionale.
4.2.5. Prelevarea din recipiente mari-cuve de stocare, autocisterne şi vagoane-cisterne.
4.2.5.1. Laptele se amestecă printr-o metodă adecvată înainte de a se proceda la eşantionare. Pentru amestecarea conţinutului marilor recipiente, cuve de stocare, autocisterne sau vagoane-cisterne, se recomandă agitarea mecanică (pct. 4.2.5.2.).
Durata amestecării depinde de perioada în care s-a lăsat în repaus laptele. Trebuie ca procedeul de amestecare aplicat în fiecare caz special să corespundă scopurilor analizei ce urmează a se efectua; eficacitatea amestecării influenţează considerabil similitudinea rezultatelor analizelor efectuate pe eşantioanele prelevate fie din diferite locuri ale lotului, fie la ieşirea din cuve la intervale regulate în timpul golirii. Modul de amestecare a laptelui (lapte crud sau lapte integral) este eficace dacă diferenţa dintre conţinutul de grăsime între două eşantioane, prelevate în aceste condiţii, este mai mică de 0,1%.
Într-un recipient mare, prevăzut cu un orificiu de golire în partea inferioară, poate exista, la punctul de evacuare, o mică cantitate de lapte nereprezentativă pentru totalul conţinutului, chiar după amestecare. De aceea, este preferabil să se  preleve eşantioanele prin deschiderile mari ale recipientului. În cazul prelevării eşantioanelor prin orificiul de vidare, se lasă să curgă o cantitate de lapte suficientă pentru  asigurarea reprezentativităţii eşantioanelor.
4.2.5.2. Amestecarea conţinutului marilor recipiente sau al cuvelor de stocare, al autocisternelor şi al vagoanelor-cisternă poate să se efectueze:  
- cu un agitator mecanic plasat în rezervor şi antrenat de un motor electric;
- cu o elice sau cu un agitator antrenat de un motor electric şi plasat în deschiderea mare, agitatorul fiind suspendat în lapte;
- în cazul autocisternelor sau vagoanelor-cisternă, prin recircularea laptelui printr-un tub flexibil de transfer racordat la o pompă şi introdus în deschiderea mare;
- prin aer comprimat filtrat şi curat; se vor utiliza o presiune şi un volum de aer minimale, pentru evitarea apariţiei gustului de rînced.
4.3. Eşantionarea automată şi semiautomată.
Pentru prelevarea eşantioanelor de lapte crud, livrat de producător, poate fi folosit un echipament de eşantionare automat sau semiautomat, conform instrucţiunilor date de laboratorul care afectează analiza sau de o altă autoritate competentă. Acest echipament trebuie supus controalelor prescrise de autoritatea responsabilă înainte de prima folosire şi ulterior - la intervale regulate. Conformitatea tehnicilor de eşantionare trebuie să fie verificată pentru a putea stabili:
- volumul minim de lapte colectat pentru eşantionare;
- proporţia manipulării ( legată de prelevarea unei cantităţi minime);
- capacitatea de transmitere a  eşantionului reprezentativ al întregii cantităţi de lapte  după o agitare calitativă.
Pentru folosirea unui echipament de eşantionare automat sau semiautomat, autoritatea naţională competentă poate prescrie:
- volumul minim de lapte de la care se pot preleva eşantioane;
- volumul minim al eşantionului;
- cantitatea maximă care poate fi antrenată;
- analizele ce pot fi efectuate  sau precauţiunile ce urmează a  fi  luate.
4.4. Eşantioanele laptelui tratat termic destinat consumului direct şi condiţionat pentru vînzarea cu amănuntul se prelevă obligatoriu în recipiente intacte şi închise. Eşantioanele trebuie, pe măsura posibilităţilor, să fie prelevate de la locul de condiţionare sau din camera frigorifică a întreprinderii de prelucrare, pe cît posibil, imediat după sau chiar în ziua prelucrării (pentru laptele pasteurizat, chiar în ziua pasteurizării).
Este oportună prelevarea unui număr de eşantioane din fiecare tip de lapte tratat termic (pasteurizat, UHT şi sterilizat) care să corespundă numărului de analize ce urmează a fi  efectuate, conform indicaţiilor laboratoarelor de cercetări sau ale  autorităţii  competente.
5. Identificarea eşantionului
Eşantionul trebuie să aibă un cod de identificare care să permită identificarea sa rapidă conform  indicaţiilor date de laboratoarele de analize sau autorităţilor competente.
6. Transportul şi stocarea eşantioanelor
Autorităţile naţionale competente, elaborează instrucţiuni privind condiţiile de transportare şi stocare, precum  şi termenele de prelevare a eşantioanelor şi de analiză a acestora, în funcţie de tipul de lapte şi de procedeul de cercetare folosit. Instrucţiunile se vor referi la următoarele:
- măsurile de precauţie în timpul transportării şi stocării eşantionului pentru protecţia lui de orice miros indezirabil şi de lumina directă a soarelui. Dacă recipientul folosit pentru transport este transparent, el trebuie izolat  de lumină;
- eşantioanele de lapte crud destinat analizelor microbiologice vor fi transportate şi conservate la o temperatură între 0oC şi 4oC. Timpul între prelevare şi analiză trebuie să fie cît mai scurt posibil şi nu poate, în nici un caz, depăşi 36 ore. Autoritatea competentă poate accepta ca temperatura de conservare să fie cuprinsă între 0oC şi 6oC, dacă termenul nu depăşeşte 24 ore;
- eşantioanele de lapte pasteurizat destinate analizelor microbiologice trebuie să fie transportate şi conservate la o temperatură situată între 0oC şi 4oC. Timpul dintre prelevare şi analiză trebuie să fie cît mai scurt posibil şi nu poate depăşi, în nici un caz, 24 ore;
- eşantioanele de lapte, altele decît cele de lapte crud şi pasteurizat, destinate analizelor microbiologice, trebuie să fie păstrate în frigiderile laboratorului şi timpul dintre prelevare şi analiză trebuie să fie cît mai scurt posibil. Precauţiile speciale ce trebuie   luate pentru unele analize sînt indicate la descrierea diverselor metode utilizabile.
Anexa nr. 2
la Norma sanitară veterinară
privind stabilirea unor metode
de analiză şi de testare a laptelui
crud şi a laptelui tratat termic
CAPITOLUL 1.
DETERMINAREA PUNCTULUI DE CONGELARE A LAPTELUI
1. Obiect şi domeniu de aplicare
Prezentul capitol descrie procedeul de determinare a punctului de congelare a laptelui integral, parţial degresat, crud, pasteurizat, tratat la temperatură ultraînaltă sau sterilizat. Procedeul descris reprezintă metoda de referinţă pentru determinarea punctului de congelare.
Pentru determinarea punctului de congelare se foloseşte un aparat termistor (crioscop cu termometru cu rezistenţă semiconductoare), în care baia controlată prin termostat este răcită prin refrigerare electrică şi unde o sondă a termistorului înlocuieşte termometrul de sticlă cu mercur.
Există două tipuri de instrumente. Primul cercetează punctul de congelare maximal pe palierul curbei de congelare, în timp ce al doilea instrument este, pentru raţiuni comerciale, reglat astfel încît să permită citirea în orice moment determinat după începutul congelării. Ştiind că curbele de congelare pot varia nu numai de la un lapte la altul, dar şi între lapte şi soluţiile standard utilizate pentru etalonare, acest procedeu de referinţă necesită folosirea instrumentelor de cercetare a palierului. Instrumentele cu citire la intervale fixe pot fi folosite în cazul analizelor de rutină pentru trierea laptelui.
Punctul de congelare poate fi folosit pentru aprecierea proporţiei de apă străină din lapte, dacă aciditatea probei nu depăşeşte 0,18 g acid lactic la 100 ml (vezi pct.7.4.).
2. Definiţie
Punctul de congelare al laptelui: valoarea măsurată după metoda descrisă în prezenta Normă sanitară veterinară şi exprimată în grade Celsius (oC).
3. Principiu
Răcirea probei pînă la 0oC corespunzător, aparatului şi începerea cristalizării prin vibraţie mecanică, antrenînd o creştere rapidă a temperaturii pînă la palierul corespunzător punctului de congelare. Instrumentul este elaborat astfel încît să se poată citi corect datele pentru două soluţii standard, folosindu-se aceeaşi metodă de lucru ca şi pentru probele de lapte. În aceste condiţii palierul dă punctul de îngheţare a laptelui înoC.
4. Aparatură şi veselă.
Material curent de laborator  
4.1. Crioscopul.
Crioscopul constă dintr-o baie de răcire controlată prin termostat, o sondă- termistor (termometru cu rezistenţă semiconductoare) cu circuit asociat, un galvanometru sau "cititor", un agitator al probei, un sistem pentru începerea congelării şi o eprubetă pentru probă.
4.1.1. Baia de răcire folosită pentru determinarea punctului de congelare a laptelui este de două tipuri:
a. Tipul cu imersie, care constă dintr-o baie perfect izolată conţinînd un lichid refrigerent, agitat astfel încît diferenţa de temperatură între două puncte oarecare să nu depăşească 0,2oC. Temperatura lichidului nu trebuie să varieze mai mult de 0,5oC faţă de valoarea nominală stabilită de producător. Este important ca lichidul din această baie să fie menţinut la un nivel constant. Întreaga suprafaţă a eprubetei cu proba, de sub reperul trasat al volumului, trebuie să fie acoperită de lichidul refrigerent.
b. Tipul cu circulaţia amestecului, constă dintr-o  baie în care un curent continuu de lichid refrigerent, va circula în jurul eprubetei cu probă. Temperatura lichidului nu trebuie să varieze mai mult de 0,5oC faţă de valoarea declarată de producător.
O soluţie apoasă de 1,2-etandiol (etilenglicol) 33% (v/v) constituie lichidul de răcire potrivit.
4.1.2. Temistorul şi circuitul conex.
Termistorul este o sondă din sticlă (diametrul max. 1,80\xf10,2 mm şi diametrul conductorului max. 0,31 mm). Constanta de timp a termistoruluî trebuie să fie mai mică de 2 secunde şi valoarea lui "v" (vezi nota) trebuie să fie ridicată. Tensiunea de serviciu, curentul şi constanta de disipaţie trebuie să fie astfel încît temperatura termistorului să nu crească peste 0,0005oC în jur de -0,512oC. Toleranta maximă a rezistenţei trebuie să fie de \xf15%.
Cînd sonda este în poziţie de funcţionare în crioscop, extremitatea părţii de sticlă trebuie să se găsească în tubul cu proba şi la 44,6 \xf1 0,1 mm sub vîrful tubului. Trebuie să se folosească un dispozitiv de centrare pentru plasarea sondei în această poziţie.
Nota: "v" defineşte caracteristicile termice ale termistorului, potrivit formulei: dR x I = v
    dT   R    T2 ,
unde: T reprezintă temperatura în grade Kelvin
R - rezistenţa în ohmi la temperatura T
dR x I
dT  R - coeficientul de temperatură.
"v" este o constantă care depinde de materialul folosit pentru fabricarea termistorului.
4.1.3. Aparatul de măsură şi citire.
4.1.3.1. Principiul măsurării.
Instrumentul utilizat trebuie să funcţioneze după principiul cercetării primului "palier" pe curba punctului de congelare. Palierul corespunde porţiunii din curba în care temperatura rămîne constantă la 0,002oC timp de cel puţin 20 de secunde.
4.1.3.2. Operaţia manuală.
Rezistenţa termistorului trebuie să fie echilibrată cu ajutorul unei punţi wheatstone sau al unui aparat similar, utilizînd rezistenţe stabile de calitate superioară cu toleranta max. de \xf1 10% şi la care coeficientul de temperatură să nu depăşească 2x10-5oC.
Rezistenţa de referinţă trebuie să aibă o linearitate în gama sa de utilizare mai bună de 0,3% din valoarea sa maximă.
Trebuie să fie posibilă ajustarea rezistenţelor pentru etalonare. Distanţa între gradaţiile cadranului de măsură nu trebuie să fie mai mare de 0,001oC.
4.1.3.3. Operaţia automată.
Aparatul de citire trebuie să permită distingerea a mai puţin de 0,001oC în gama 0 -1oC.
Stabilitatea aparatului de citire şi circuitul anexat lui, nu trebuie să aibă o abatere mai mare de 0,001oC între două citiri succesive ale aceleeaşi temperaturi. Linearitatea circuitului trebuie să fie astfel încît nici o eroare mai mare de 0,001oC să nu fie introdusă în vreun punct oarecare în gama -0,400 - 0,600oC în timp ce aparatul este folosit corect.
4.1.4. Agitatorul.
Pentru agitarea probei se foloseşte o tijă de metal inertă faţă de lapte, cu un diametru cuprins între 1 şi 1,5 mm.
Agitatorul trebuie să aibă amplitudinea reglată şi să fie instalat vertical, iar extremitatea sa inferioară să fie la acelaşi nivel cu vîrful sondei termistorului. Se admite o tolerantă în jur de 1,5 mm în plus sau în minus faţă de această poziţie. Agitatorul trebuie să vibreze lateral cu o amplitudine suficientă, indicată de fabricant (cel puţin de 1,5 mm) pentru a asigura o temperatură uniformă a probei în timpul determinării. În timpul funcţionării agitatorul nu trebuie să atingă sonda termistorului sau peretele tubului.
4.1.5. Dispozitivul de începere a congelării. Acest dispozitiv, indiferent ce fel de aparat este, pus în funcţie trebuie să asigure începerea instantanee a congelării probei, astfel încît temperatura acestei probe să se situeze în preajma punctului de congelare. Agitatorul poate fi utilizat în acest scop, una din metode constă în mărirea amplitudinii de vibraţie timp de 1-2 secunde astfel încît agitatorul să atingă peretele tubului cu proba.
4.1.6. Tuburile pentru probă.
Tuburile pentru probe trebuie să fie din sticlă, cu lungimea de 50,8 \xf1 0,1 mm, diametrul exterior 16,0 \xf1 0,1 mm şi diametrul interior 13,5 \xf10,1 mm. Grosimea sticlei nu trebuie să varieze mai mult de 0,1 mm pe ansamblul peretelui. Tuburile trebuie să aibă un reper trasat la 29,8 mm sub gură (21 mm deasupra bazei tubului) pentru a indica un volum de probă de 2,5 \xf1 0,1 ml.
4.1.7. Alimentarea cu curent.
Tensiunea curentului trebuie să fie permanentă, atît la interiorul, cît şi la exteriorul aparatului, încît eventualele fluctuaţii să nu depăşească \xf1 1% din valoarea nominală atunci cînd alimentaţia principală variază cu 6%.
4.2. Balanţe analitice.
4.3. Baloane cotate de 1000 ml, clasa A.
4.4. Etuva electrică cu ventilator, reglabilă la 130 \xf1 1oC sau cuptor electric cu ventilator, reglabil la 300 \xf1 25oC.
4.5. Exicator.
5. Reactivi
5.1. Apa distilată într-un aparat de sticlă barosilicată, fiartă şi răcită la 20\xf12oC, cu un tub absorbant cu anhidrida carbonică.
5.2. Clorura de sodiu, de calitate analitică, fin majorată, uscată timp de 5 ore la 300 \xf1 25oC în cuptor electric (pct.4.4) sau uscată în etuvă (pct.4.4) la 130\xf11oC timp de cel puţin 24 ore şi răcită la temperatură ambiantă într-un exicator eficace.
5.3. Soluţiile standard.
Se cîntăreşte cantitatea necesară (vezi tabelul de mai jos) de clorură de sodiu uscată (pct.5.2). Se dizolvă cu apă şi se trece cantitativ în balon cotat de 1000 ml şi se completează la semn cu apa, la 20\xf12oC.
Această soluţie se conservează timp de max. 2 luni la 5oC în flacon de polietilenă bine inclus, cu capacitate max. de 250 ml.
Punctul de congelare al soluţiilor de clorură de sodiu la 20oC:
   gNaCl/1         oC
6,859      -0,408
7,818      -0,464
8,149      -0,483
8,314      -0,492
8,480      -0,502
8,646      -0,512
8,811      -0,521
8,977      -0,531
9,143      -0,541
10,155      -0,600
Înainte de folosire, soluţia standard se omogenizează prin agitarea cu atenţie a balonului şi răsturnări succesive. Balonul nu se agită energic pentru evitarea înglobării aerului.
Prizele de testare dintr-o soluţie standard trebuie efectuate prin scurgere într-un pahar uscat şi curat. Nu se utilizează pipeta. Nu se utilizează soluţiile conţinute în flacoane 3/4 goale şi nu se utilizează soluţiile mai vechi de două luni dacă ele nu conţin un fungicid (soluţie thiomersal, 10 g/1 de exemplu).
6. Etalonarea crioscopului şi termistorului
Crioscopul trebuie să fie reglat astfel încît temperatura ambiantă să nu se abată cu mai mult de 1oC de la temperatura de etalonare. Crioscopul nu trebuie expus la lumina solară, la curenţi de aer sau la o temperatură ambiantă mai mare de 26-27oC.
Se va asigura că, crioscopul este în stare de funcţionare conform indicaţiilor fabricantului, şi că el a fost pus în funcţie cel puţin 12 ore înainte de a trece la etalonare. Se verifică poziţia sondei, amplitudinea vibraţiilor agitatorului şi temperatura lichidelor criogene.
Se aleg două soluţii standard (vezi tabelul de mai sus) apropiate de valoarea presupusă a punctului de îngheţare a laptelui ce se analizează. Diferenţa între punctul de îngheţare a celor două soluţii să nu depăşească -0,100oC. (Cu unele tipuri de crioscoape disponibile, circuitul anexat termistorului este conceput astfel încît să se stabilizeze la o valoare specifică a punctului de congelare în gama de măsuri ale aparatului. În acest caz, selectarea dintre soluţiile standard, a unei soluţii standard cu acelaşi punct de congelare uşurează etalonarea; fabricantul va indica această valoare).
Se introduc cu pipeta 2,5\xf10,1 ml din soluţia standard într-un tub curat şi uscat, apoi se procedează la măsurare cu ajutorul crioscopului.
Nota: Tuburile standard folosite pentru etalonare trebuie să fie fabricate şi tratate ca cele folosite pentru probele de lapte (acelaşi tip de sticlă, spălate şi clătite cu apă demineralizată). Temperatura soluţiilor standard trebuie să fie identică cu aceea a probelor de lapte.
Se procedează la controlul etalonării, respectîndu-se indicaţiile fabricantului, pînă cînd citirea crioscopului este identică cu punctul de congelare al soluţiei standard. Se repetă operaţiunea cu altă soluţie standard şi se continuă în mod alternativ pînă cînd citirile succesive vor demonstra pentru fiecare soluţie valoarea corectă a punctului lor de congelare, fără reglare suplimentară. Crioscopul este atunci gata de folosire şi indică direct, fără corecţie, punctul de congelare al probei de lapte.
7. Prepararea probei de analizat
7.1. Dacă este necesar, se conservă proba la temperatura între 0 şi 5oC.
7.2. Se elimină din probă toate impurităţile vizibile sau orice grăsime solidă prin filtrare, dacă este necesar, într-un recipient uscat şi curat şi proba se omogenizează lent. Filtrul folosit trebuie să fie inert faţă de lapte şi eficace la temperatura laboratorului.
7.3. Laptele poate fi analizat la temperatura sa de conservare (între 0 şi 5oC) sau poate fi adus la temperatura laboratorului imediat înainte de începerea analizei, în timpul folosirii lor, soluţiile standard şi probele de lapte se vor aduce la aceeaşi temperatură.
7.4. Determinarea acidităţii titrabile a laptelui, se va face pe cît posibil în acelaşi timp cu determinarea punctului de congelare. Probele a căror aciditate depăşeşte 0,18 g acid lactic pentru 100 ml de lapte nu pot fi folosite pentru analiză.
7.5. Laptele UHT şi laptele sterilizat trebuie lăsat în repaus cel puţin 20 minute într-un recipient descoperit înainte de a fi analizat.
8. Mod de lucru
8.1. Verificări preliminare.
Se va asigura că nivelul şi temperatura lichidului de răcire sînt conforme cu indicaţiile fabricantului şi că sonda termistorului se găseşte în tubul de testare gol, la amplasarea exactă a probei. Se pune crioscopul în funcţie, se asigură că lichidul de răcire este convenabil agitat sau circulă corect, după caz. Dacă crioscopul a funcţionat cel puţin 12 ore, se verifică temperatura lichidului de răcire, ca şi poziţia agitatorului şi amplitudinea vibraţiilor.
8.2. Verificarea de rutină a etalonării.
Înaintea fiecărei serii de probe, se măsoară punctul de congelare al unei soluţii standard de clorură de sodiu (de exemplu, o soluţie cu punctul de congelare de -0,512oC) pînă cînd valorile obţinute la două determinări consecutive nu diferă mai mult de 0,001oC. Dacă media acestor valori diferă cu mai mult de 0,002oC faţă de punctul de congelare al soluţiei standard, se etalonează din nou crioscopul aşa cum s-a descris la pct.6.
Dacă crioscopul este folosit continuu, se efectuează verificarea de rutină a etalonării cel puţin o dată pe oră, respectîndu-se indicaţiile fabricantului.
8.3. Determinarea punctului de congelare a laptelui.
Se omogenizează conţinutul recipientului cu proba de lapte prin agitare moderată şi răsturnări succesive. Se evită agitarea riguroasă pentru împiedicarea încorporării de aer.
Se introduce cu o pipetă volumul de 2,5\xf10,1 ml lapte într-un tub curat şi uscat. Se va asigura că sonda şi agitatorul sînt curate şi uscate, dacă este necesar se şterg de jos în sus cu pînza moale şi curată.
Se aşează tubul cu proba în crioscopul etalonat, respectîndu-se indicaţiile fabricantului. Laptele se răceşte şi se începe congelarea pînă aproape de 0,1oC de temperatura indicată de fabricant. (Pe unele aparate automatizate, această temperatură poate fi ataşată pe un cititor digital, pe aparatele manuale, precizia necesară este obţinută prin asigurarea că, congelarea începe cînd acul sau firul galvanometrului coincide cu reperul potrivit).
Dacă, dintr-o raţiune oarecare, congelarea începe înaintea sau după plaja de temperatură indicată, se opreşte analiza şi se începe din nou cu o altă probă de lapte. Dacă şi această probă se congelează, de asemenea, înaintea temperaturii indicate, se încălzeşte o probă de lapte la 45oC şi se menţine la această temperatură 5 minute pentru a permite topirea grăsimii închegate. Se răceşte apoi la temperatura de testare şi se face imediat o nouă analiză. Temperatura laptelui, după începutul congelării, creşte rapid pînă la valoarea în care rămîne, practic, constantă un oarecare timp înainte de scădere. Punctul de congelare corespunde temperaturii celei mai ridicate în timpul acestei perioade, valoare care se revelează.
Nota: Timpul cît temperatura rămîne constantă şi intervalul de timp între începutul congelării şi obţinerea temperaturii celei mai ridicate diferă de la o probă la alta şi este considerabil mai scurt pentru apă şi soluţiile standard de clorură de sodiu decît pentru lapte. Este esenţial să se releveze temperatura cea mai înaltă.
Cînd măsurarea este efectuată în mod satisfăcător, se scoate tubul, se clăteşte cu apă, apoi se şterge de jos în sus termistorul şi agitatorul cu o pînză moale şi curată se procedează la a doua determinare cu altă probă.
Dacă diferenţa între punctul de congelare obţinut este superior valorii de repetabilitate (0,004oC), se efectuează a doua determinare pe o altă probă. Dacă valorile celor două determinări concordă la 0,004, ele se reţin şi se utilizează la calculul rezultatului final.
8.4. Răcirea sondei.
După folosirea aparatului se aşează un tub gol în locul eşantionului şi se cufundă mandrina pentru a păstra sonda la frig. (Cu unele tipuri de crioscop, aceasta nu este posibil; se va asigura în acest caz ca sonda să fie bine răcită înaintea efectuării măsurătorilor, procedîndu-se, de exemplu, la mai multe determinări experimentale pînă la obţinerea citirilor identice).
9. Exprimarea rezultatelor
9.1. Calculul.
Dacă etalonarea este confirmată după verificarea de rutină, se ia ca rezultat media a două valori acceptabile obţinute pentru punctul de congelare, rotunjit la a 3-a zecimală.
Dacă suma a două valori acceptabile ale determinărilor efectuate în dublu este un număr impar, media trebuie rotunjită la valoarea pară cea mai apropiată, cum se arată în exemplul următor:
Punct de congelare QC.
Valorile determinărilor duble
Media  
- 0,544-0,545>0,544
- 0,545-0,546>0,546
9.2. Fidelitate.
9.2.1. Repetabilitate (r)>0,004oC.
9.2.2 Reproductibililate (R)>0,006oC.
CAPITOLUL 2.
DETERMINAREA ACTIVITĂŢII FOSFATAZICE
1. Obiect şi domeniu de aplicare
Prezentul capitol descrie metoda de determinare a activităţii fosfatazice din laptele pasteurizat care reprezintă metoda de referinţă.
2. Definiţie
2. 1. Activitatea fosfatazică constă în măsurarea fosfatazei alcaline active prezente în produs; aceasta se exprimă prin cantitatea de fenol în mg/ml de lapte în condiţiile descrise mai jos.
2.2. Activitatea fosfatazică a laptelui este negativă dacă este mai mică de 4 mg/ml.
3. Principiu
Fosfataza eventual prezentă în proba de lapte va elibera fenol din fenilfosfatul disodic adăugat. Fenolul eliberat reacţionează cu dibromchinon-clorimida formînd dibrom-indofenol (de culoare albastră), ce se măsoară la 610 nm faţă de o probă blanc (eşantionul în care enzima este distrusă).
4. Reactivi
4.1. Tampon borat-hidroxid de bariu.
4.1.1. Se dizolvă 50,0 g hidroxid de bariu (Ba(OH)2*8H2O) în apă şi se aduce la 1000 ml.
4.1.2. Se dizolvă 22,0 g acid boric (H3B03) în apă şi se aduce la 1000 ml.
4.1.3. Se încălzesc 500 ml din fiecare soluţie la 50oC, se amestecă, se răcesc repede la 20oC, se ajustează pH-ul, dacă este necesar, la 10,6\xf10,1 cu ajutorul soluţiei 4.1.1 sau 4.1.2 şi se filtrează. Soluţia se păstrează în recipient bine închis.
4.1.4. Înainte de utilizare soluţia se diluează cu un volum de apă echivalent.
4.2. Tampon pentru dezvoltarea culorii.
Se dizolvă 6,0 g metaborat de sodiu (NaB02) sau 12,6 NaB02 * 4H2O şi 20,0 clorură de sodiu (NaCl), în apă şi se completează la 1000 ml.
4.3. Tampon de colorare diluat.
Se diluează 10 ml tampon de dezvoltare a colorării (4.2.) în apă şi se aduce la 100 ml apă.
4.4. Substrat tamponat.
Se dizolvă 0,1g fenolfosfat disodic deshidratat liber de fenol în 100 ml tampon (4.1.3.) sau se dizolvă 0,5 g fenolfosfat disodic în 4,5 ml tampon de dezvoltare a culorii (4.2), se adaugă două picături BQC (4.6) şi se lasă la temperatura camerei timp de 30 minute. Se extrage culoarea astfel formată cu 2,5 ml butanol-1 şi se lasă în repaus pînă la separarea butanolului. Se decantează butanolul şi se elimină. Se repetă operaţia dacă este necesar.
Soluţia poate fi păstrată cîteva zile la frigider, lăsîndu-se cloraţia să se dezvolte şi procedîndu-se la o nouă extracţie înainte de folosire. Se prepară substratul tamponat înainte de întrebuinţare, dizolvîndu-se 1 ml din această soluţie cu 100 ml cu tampon borat şi hidroxid de bariu (4.1.3.).
4.5. Defecant de cupru-zinc.
Se dizolvă 3,0 g sulfat de zinc (ZnSO4*7H2O) şi 0,6 g sulfat de cupru (CuSp4*5H20) în apă şi se completează la 100 ml.
4.6. Soluţia de dibrom -2,6 chinon-elorimidă (soluţia BQC).
Se dizolvă 40\xf11 mg dibrom -2,6 chinonclorimidă (C6H2Br2ClN06) în 10 ml alcool etilic 96% (v/v). Se conservă la frigider în sticlă brună. Dacă îşi schimbă culoarea sau dacă este mai veche de 1 lună soluţia se aruncă.
4.7. Soluţia de sulfat de cupru.
Se dizolvă 0,05 g sulfat de cupru (II) (CuS04*5H20) în apă şi se completează la 100 ml.
4.8. Soluţia standard de fenol.
4.8.1. Se cîntăresc 200\xf12 mg fenol anhidru pur, se trece în balon cotat de 100 ml, se dizolvă cu apă, se completează la 100 ml şi se omogenizează. Soluţia este stabilă mai multe luni, la frigider.
4.8.2. Se diluează 10 ml din soluţia concentrată cu apă, se completează la 100 ml. 1 ml conţine 200mg fenol.
5. Aparatură şi veselă
Note:      
a) Întreaga veselă, ca şi dopurile şi instrumentele de etalonare, să fie riguros curăţate. Este recomandabil să se clătească cu apă distilată proaspăt fiartă.
b) Unele tipuri de dopuri din plastic pot antrena o contaminare fenolică; utilizarea lor nu este permisă.
Materiale obişnuite de laborator:  
5.1. Balanţa analitică.
5.2. Baie de apă reglabilă la 37\xf11oC.
5.3. Spectrofotometru, ce permite efectuarea citirii la lungimea de undă de 610 nm.
5.4. Eprubete de 16 sau 18 mm x 150 mm, de preferinţă gradate la 5 şi 10 ml.
5.5. Pipete.
5.6. Pîlnii de sticlă de dimensiunile necesare, spre exemplu, cu diametrul de 5 cm.
5.7. Filtre plisate cu diametrul de 9 cm, potrivite pentru o viteză medie de filtrare.
5.8. Baloane cotate pentru prepararea soluţiilor standard.
6. Mod de lucru
Note:
a) Se va evita lumina directă în timpul determinării.
b) Urmele de salivă sau de transpiraţie pot da rezultate fals pozitive şi trebuie evitate. Trebuie luate în consecinţă precauţiile particulare la pipetare.
6.1. Prepararea probei.
6.1.1. Se va efectua analiza imediat după recoltare, în caz contrar, proba se păstrează la frigider maxim două zile.
6.2. Luarea probei.
Se pipetează în fiecare din două eprubete (5.4.) 1 ml de probă, folosindu-se una din cele două eprubete ca martor sau probă blanc.
6.3. Determinarea.
6.3.1. Se încălzeşte proba - blanc timp de două minute în apă fierbinte; se acoperă eprubeta şi vasul ce conţine apă fierbinte cu o folie de aluminiu. Se răceşte repede la temperatura camerei.
6.3.2. Se tratează proba şi blancul în acelaşi fel pentru restul operaţiunii. Se adaogă 10 ml substrat tamponat (4.4) şi se omogenizează.
6.3.3. Se incubează imediat testele în baia de apă (5.2) timp de 60 minute omogenizînd din timp în timp (cel puţin de 4 ori).
6.3.4. Se încălzesc în apa fierbinte, timp de două minute, în aceleaşi condiţii ca la pct. 6.3.1. Se răcesc apoi repede la temperatura camerei.
6.3.5. Se adaugă 1 ml defecant cupru-zinc (4.5) în fiecare eprubetă şi se omogenizează cu precauţie.
6.3.6. Se filtrează prin filtru de hîrtie uscat, se aruncă primii 2 ml, se refiltrează dacă este necesar pînă cînd filtratul devine complet limpede şi se recoltează 5 ml într-o eprubetă.
6.3.7. Se adaugă 5 ml tampon de dezvoltare a culorii (4.2.).
6.3.8. Se adaugă 0,1 ml soluţie BQC (4.6), se omogenizează şi se lasă 30 minute la temperatura camerei pentru dezvoltarea culorii.
6.3.9. Se măsoară absorbanta faţă de martor la lungimea de undă de 610 nm.
6.3.10. Dacă absorbanta de la 6.3.9. depăşeşte absorbanta soluţiei standard ce conţine 20 mg fenol în eprubetă măsurată conform pct. 6.4.4., se repetă determinarea cu diluţii apropiate probei. Se prepară această diluţie amestecînd un volum din eşanţion la un volum corespunzător al unei porţiuni din acelaşi eşanţion adus cu precauţie la fierbere pentru inactivarea fosfatazei.
6.4. Prepararea curbei de etalonare.
6.4. 1. Se prepară cu ajutorul soluţiei standard de fenol (4.8.2.) o gamă de soluţii standard care conţin 0(martorul sau proba blanc), 2,5,10, şi 20 mg fenol/ml.
Se pipetează cîte 1 ml apă şi 1 ml din cele 4 soluţii standard de fenol în fiecare din cele 5 eprubete de testare.
6.4.2. Se adaugă în fiecare eprubetă 1 ml soluţie de sulfat de cupru (II) (4.7), 5 ml tampon de colorare diluat (4.3.), 3 ml apă şi 0,1 ml soluţie BQC (4.6); se omogenizează.
6.4.3. Se lasă 30 minute la temperatura camerei pentru dezvoltarea culorii.
6.4.4. Se măsoară absorbanta în raport cu blancul la lungime de undă de 610 nm (5.3.).
6.4.5. În funcţie de valorile absorbţiei (6.4.4.) obţinute pentru fiecare cantitate de fenol adăugată (6.4.1.) se calculează linia de regresie prin metoda celor mai mici pătrate.
7. Exprimarea rezultatelor
7.1. Calcul şi formulă.
7.1.1. Pe baza măsurării absorbantei (6.3.9.) se calculează cantitatea de fenol cu ajutorul liniei de regresie (6.4.5.).
7.1.2. Se calculează activitatea fosfatazică, exprimată în mg fenol/ml lapte pasteurizat cu ajutorul formulei următoare:
Activitatea fosfatazică = 2,4 x A x D,
unde:
A: este cantitatea de fenol în mg obţinută la 7.1.1.  
D: este factorul de diluţie al diluţiei efectuate conform p. 6.3.10 (în absenţa diluţiei, D = 1).
2,4: este factorul de diluţie (5/12 din 1 ml probă). Se consideră 6.2 în relaţie cu pct. 6.3.2, 6.3.5 şi 6.3.6.
7.2. Fidelitate.
7.2.1. Repetabilitate (r): 2 mg fenol/ml.
7.2.2. Reproductibilitatea (R): 3 (preliminar) mg fenol/ml.
7.2.3. Dacă o diluţie este efectuată conform pct. 6.3.10. limitele pretinse la pct. 7.2.1. şi 7.2.2. se referă la rezultatele obţinute cu eşantioane diluate.
CAPITOLUL 3.
DETERMINAREA ACTIVITĂŢII PEROXIDAZICE
1. Obiect şi domeniu de aplicare
Prezentul capitol descrie metoda de determinare a prezenţei sau a absenţei peroxidazei în lapte, căruia i se controlează pasteurizarea, care reprezintă metoda de referinţă.
2. Definiţii
Reacţia pozitivă a testului peroxidazei: Dacă laptele a fost pasteurizat incorect, o coloraţie albastră apare în 30 de secunde după amestecare. Reacţia negativă a testului peroxidazei: nu apare nici o culoare în 30 de secunde după amestecare.
3. Principiu
Peroxidaza descompune peroxidul de hidrogen. Oxigenul atomic eliberat transformă, prin oxidare, parafenilendiamina incoloră în indofenol purpuriu (testul Storch). Intensitatea de culoare este proporţională cu concentraţia de enzimă.
4. Reactivi
4.1. Soluţie de 1,4-parafenilendiamină.
Se dizolvă 2,0 g de 1,4-parafenilendiamină (C6H8N2) în apă caldă (50oC) şi se completează la 100 ml. Soluţia se conservă în flacon brun cu dop de sticlă, ferită de lumină şi la rece. După 1-2 zile de la preparare soluţia formează un sediment ce trebuie diminuat.
4.2. Soluţia de peroxid de hidrogen.
Se diluează 9 ml peroxid de hidrogen 30% în apă şi se completează la 100 ml. Pentru stabilizare se adaugă 1 ml acid sulfuric concentrat la 1 litru soluţie.
Soluţia de peroxid de hidrogen este stabilă timp de o lună dacă se conservează la rece şi la adăpost de lumină, în flacon bine închis cu dop de sticlă şi fără impurităţi organice.
5. Mod de lucru
5.1. Se introduc într-o eprubetă curată şi prevăzută cu capac adecvat 5 ml lapte de analizat.
5.2. Se adaugă 5 ml de soluţie de 1.4-parafenilendiamină (4.1.).
5.3. Se adaugă 2 picături din soluţia de hidrogen (4.2.).
5.4. Se examinează culoarea în primele secunde de la omogenizare. Dacă apare o coloraţie albastră după mai mult de 30 de secunde de la adăugarea reactivilor, reacţia nu este specifică.
CAPITOLUL 4.
NUMĂRAREA MICROORGANISMELOR DIN LAPTE PRIN METODA DE NUMĂRARE A COLONIILOR OBŢINUTE LA 30oC
1. Obiect şi domeniu de activitate
Prezentul capitol descrie procedeul de numărare a microorganismelor din lapte prin tehnica numărării coloniilor obţinute la 30oC ce reprezintă metoda de referinţă. Metoda este aplicabilă la laptele crud, laptele pasteurizat, lapte UHT şi la laptele sterilizat preincubat la 30oC timp de 15 zile.
2. Definiţie
Prin "microorganisme" se înţeleg toate organismele care formează colonii, numărabile după o incubare în aerobioză în condiţiile de lucru descrise.
3. Principiu
Se amestecă un volum determinat din proba de lapte cu mediul de cultură în cutii Petri şi se lasă la incubat la 30oC timp de 72 ore. Se numără coloniile şi se calculează numărul microorganismelor pe mililitru de lapte crud sau pasteurizat sau pe 0,1 mililitru de lapte sterilizat sau UHT preincubat.
4. Aparatură şi sticlărie
Material curent de laborator:
4.1. Aparatură.
4.1.1. Etuvă cu aer cald, reglabilă la 170oC-175oC.
4.1.2. Autoclav, reglabil la 121o\xf11oC.
4.1.3. Etuva reglabilă la 30o\xf11oC.
4.1.4. pH-metru, cu corecţie de temperatură, sensibil la aproximativ 0,1 unităţi de pH.
4.1.5. Baie de apă reglabilă la 45o\xf11oC.
4.1.6. Lupa cu putere de mărire 2-4x.
4.1.7. Lupa cu putere de mărire 8-10x.
4.1.8. Numărător cu înregistrare.
4.1.9. Agitator capabil de a amesteca 1 ml de eşantion de lapte sau dintr-o diluţie zecimală cu 9 ml diluam şi al cărui principiu de funcţionare se bazează pe o  mişcare de rotaţie excentrică a conţinutului tubului de testare.
4.2. Vesela.
4.2.1. Tuburi (eprubete) cu dopuri corespunzătoare şi de capacitate adecvată pentru a conţine şi cu un spaţiu suficient care să permită o agitaţie convenabilă a 10 ml din prima diluţie sau din diluţiile zecimale următoare.
4.2.2. Fiole (baloane) de 150-250 ml capacitate sau tuburi de cca 20 ml capacitate pentru a conţine mediul de cultură.
4.2.3. Pipete (cu dop de vată) de sticlă sau din material sintetic sterile, neciobite, de 1 ml capacitate nominală, cu un orificiu de scurgere de 1,75 -3 mm.
4.2.4. Cutii Petri de sticlă sau de material sintetic sterile, transparente, incolore, cu fundul cu un diametru interior în jur de 90-100 mm. Adîncimea interioară trebuie să fie de cel puţin 10 mm. Fundul nu trebuie să prezinte nici o neregularitate susceptibilă să împiedice numărarea coloniilor.
4.2.5. Sterilizarea sticlăriei.
Sticlăria trebuie să fie sterilizată prin una din următoarele metode:
a) la etuva cu aer cald, la o temperatură de 170-175oC timp de cel puţin o oră (4.1.1.).
b) la autoclav, la o temperatură de 121oC\xf11oC timp de cel puţin 20 minute (4.1.2.).
În cazul autoclavului, trebuie luată orice precauţie pentru a asigura penetraţia adecvată a vaporilor; dacă materialul este sterilizat în recipiente, acestea nu trebuie să fie închise ermetic, dopurile sau fiolele trebuie să fie slăbite.
Pipetele trebuie sterilizate la etuva cu aer cald (4.l.1.).
5. Mediu de cultură pentru numărarea germenilor din lapte în placa cu geloză
5.1. Compoziţie:   Extract de drojdii....................2,5 g
      Triptonă.................................5,0 g
      D(+) glucoză sau dextroza .....1,0 g
      Lapte - praf degresat ............. l,0 g
      Agar-agar...............................10 -15 g (după
    capacitatea de gelificare)
      Apă........................................l000 ml.    
Laptele praf degresat trebuie să fie lipsit de substanţe inhibitoare, ceea ce se va verifica cu ajutorul testelor comparative realizate folosind un lapte praf degresat recunoscut ca fiind lipsit de asemenea substanţe.
Preparare:
Se pune în suspensie dizolvîndu-se în apă, în ordine, extractul de drojdii, glucoza şi la sfîrşit, laptele-praf degresat. Încălzirea suspensiei uşurează operaţiunea. Se adaugă apoi agar-agarul şi se pune la fiert agitînd frecvent pînă la dizolvarea completă a agar-agarului sau se încălzeşte la vapori timp de aproximativ 30 minute.
Se filtrează prin hîrtie de filtru, dacă este necesar.
Se verifică pH-ul cu ajutorul unui pH-metru (4.1.4.), dacă este necesar, se ajustează pH-ul folosind o soluţie (de cel puţin 0,1 mol/1) de hidroxid de sodiu sau de acid clorhidric în aşa fel ca, după sterilizare să fie 6,9\xf10,1 la25oC.
5.2. Repartiţia, sterilizarea şi conservarea mediului de cultură.
Se repartizează mediul (5.1.) în cantităţi de 100-150 ml în flacoane sau de 12-15 ml în tuburi (4.2.2.). Se pun dopurile la flacoane si la tuburi.
Se sterilizează la autoclav (4.1.2.) la 121oC\xf11oC timp de 15 minute. Se verifică pH-ul mediului.
Dacă mediul de cultură nu este folosit imediat, se păstrează la adăpost de lumină la 1o-5oC timp de o lună maxim după prepararea sa.
5.3. Mediul de cultură complet deshidratat vîndut în comerţ.
Mediul de cultură (5.1.) poate fi preparat dintr-un mediu de cultură complet deshidratat vîndut în comerţ. Se urmăresc indicaţiile fabricantului, dar se adaugă laptele praf degresat înainte de dizolvare dacă el nu intră în compoziţia produsului.
Se ajustează pH-ul la 6,9\xf10,1 la 25oC după modul descris la 5,1., apoi se repartizează, se sterilizează şi se stochează mediul conform indicaţiilor date la pct.5.2.
6. Diluanţi
6.1. Soluţie de peptonă/sare
Compoziţie:
Peptonă l,0g
Clorură de sodiu (NaCl) 8,5g  
Apă 1000 ml  
Preparare:
Se dizolvă componentele în apă, încălzind dacă este necesar.
Se verifică pH-ul cu pH-metru (4.1.4); dacă este necesar, se ajustează pH-ul folosind o soluţie (cel puţin 0,1 mol/1) de hidroxid de sodiu sau de acid clorhidric, aşa încît, după sterilizare, să fie de 7,0\xf10,1 la o temperatură de 25oC.
6.2. Repartiţia, sterilizarea şi conservarea diluantului.
Se repartizează diluantul (6.1.) în tuburi de testare (4.2.1.) astfel încît, după sterilizare, fiecare tub să conţină 9 \xf1 0,2 ml diluant. Se pune dopul la tuburi.
Se sterilizează la autoclav (4.1.2.) la 121o\xf11oC timp de 15 minute.
Se verifică pH-ul diluantului.
Dacă diluantul nu se foloseşte imediat, se păstrează la adăpost de lumină la 1o-5oC timp de o lună maxim după prepararea sa.
6.3. Diluanţi complet deshidrataţi din comerţ.
Pudrele sau comprimatele deshidratate vîndute în comerţ pot servi la prepararea diluantului (6.1.). Se urmează instrucţiunile fabricantului. Se ajustează pH-ul după modul descris la 6.1. şi se repartizează, se sterilizează şi se stochează diluanţii după indicaţiile date la pct.6.2.
7. Mod de lucru
7.1. Topirea mediului.
Înainte de a executa examenul microbiologic, se topeşte rapid cantitatea de mediu necesară şi se răceşte mediul la 45o \xf1 1oC la baia de apă (4.1.5.).    
7.2. Prepararea eşantionului de lapte.
Se amestecă convenabil eşantionul pentru a obţine o repartiţie a microorganismelor cît mai omogenă posibil, rotind rapid de 25 ori recipientul care conţine eşantionul. Se evită formarea spumei sau se lasă spuma să se disperseze. Timpul între amestecarea şi prelevarea prizei de testat nu trebuie să depăşească 3 minute.
7.3. Prepararea primei diluţii (10-1) (lapte crud şi pasteurizat).
Se transferă cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.3.) 1 ml eşantion (7.2.) de lapte crud sau de lapte pasteurizat în 9 ml diluant (6.1.) evitîndu-se orice contact între pipetă şi diluant. Temperatura diluantului trebuie să fie sensibil aceeaşi cu aceea a eşantionului de lapte.  
Se amestecă cu grijă această primă diluţie cu ajutorul agitatorului (4.1.9.) timp de 5-10 secunde. Se obţine astfel o primă diluţie I0-1.
7.4. Prepararea diluţiilor zecimale următoare (lapte crud şi lapte pasteurizat).
Se transferă, cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.3,), 1 ml din prima diluţie (7.3.) în 9 ml de diluant (6.1.) urmînd indicaţiile date la 7.3.
Se obţine o diluţie 10-2.
Se repetă aceste operaţiuni pentru a obţine diluţiile zecimale următoare pînă la obţinerea numărului adecvat de microorganisme (8.1.1.).
7.5. Inocularea cutiilor Petri.
7.5.1. Lapte crud: se transferă cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.3.), 1 ml de eşantion şi/sau din diluţia zecimală într-o cutie (4.2.4.). Analiza trebuie efectuată prin examinarea a cel puţin două diluţii. Pentru fiecare diluţie se prepară o cutie selecţionată, cum se cade de acord (8.1.1.).
7.5.2. Lapte pasteurizat: se trece cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.3.), 1 ml de eşantion şi/sau din diluţia zecimală într-o cutie (4.2.4.). Analiza trebuie să se efectueze la cel puţin două diluţii. Pentru fiecare diluţie, se prepară două cutii selecţionate.
7.5.3. Laptele UHT şi laptele sterilizat (analiza, după incubare timp de 15 zile la 30oC).
Se transferă, cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.3.), 0,1 ml de eşantion de lapte (7.2) într-o cutie (4.2.4.). Se prepară două cutii.
7.6. Turnarea mediului.
Se varsă aproximativ 15-18 ml mediu (7.1.) în fiecare cutie însămînţată. Se amestecă imediat prin rotaţia cutiei Petri, pentru a obţine o repartiţie regulată a coloniilor după incubare.
Timpul între prepararea şi amestecarea eşantionului, după tipul de lapte, a probei de testat sau a diluţiei cu mediul nu trebuie să depăşească 15 minute. Se lasă în repaus pe o suprafaţă rece şi curată pînă la solidificarea mediului.
7.7. Incubaţia cutiilor Petri.
Se aşează cutiile în etuvă (4.1.3.). Se incubează cutiile răsturnate. Nu se suprapun mai mult de şase. Teancurile de cutii nu trebuie să se atingă între ele, nici cu pereţii sau partea superioară a etuvei. Se incubează la 30oC\xf11oC timp de 72 \xf12 ore.
7.8. Numărarea coloniilor.
Se efectuează numărarea coloniilor din cutiile Petri care nu conţin mai mult de 300 colonii.
Se examinează cutiile la lumina atenuată. Se evită confundarea părticelelor de materii precipitate cu coloniile de mărimea unui capăt de ac cu gămălie: în caz de dubiu, se procedează la un examen minuţios utilizînd dacă este necesar, o lupă cu putere de mărire superioară (4.1.7.), pentru a deosebi coloniile de materiile străine.
Dacă coloniile invadatoare acoperă mai puţin de un sfert din cutie, se numără coloniile din partea neatinsă de invadare a cutiei şi se calculează numărul corespunzător pentru cutia întreagă. Daca coloniile invadatoare acoperă mai mult de un sfert din cutie, se elimină cutia.
8. Calciul şi exprimarea rezultatelor
8.1. Laptele crud şi pasteurizat.
8.1.1. Se folosesc rezultatele din cutiile care conţin între 10 şi 300 colonii (a se vedea 8.1.3. şi 8.1.4.).
8.1.2. Se calculează numărul de microorganisme pe mililitru de lapte crud sau pasteurizat cu ajutorul formulei următoare:
  SC/ml =             SC            
                                (n1 + 0,1 n2)d
în care:      
SC  - este suma totală a coloniilor numărate conform 8.1.1.
(n 1 +0,1 n 2)d - este egal cu volumul însămînţat în care:  
n1  - este numărul de cutii numărate din prima diluţie,
n2   - este numărul de cutii numărate din a doua diluţie,    
d  - este factorul de diluţie de la care s-a pornit numărarea.
Numărul este rotunjit la două cifre semnificative. Cînd cifra de rotunjit este 5, se rotunjeşte în aşa fel ca cifra imediat din stînga sa fie pară.
Exemplu (lapte pasteurizat) :
Diluţia 10-2:  278 şi 290 colonii
Diluţia 10-3:  33 şi 28 colonii
Numărul/ml = 278+290+33+28 = 629 = 28590 = 29000 = 2,9x104
                        (2+0,1 x 2) 10-2    0,022  
8.1.3. Dacă toate numărările sînt mai mici de 10, se va nota că numărul de microorganisme pe mililitru este mai mic de 10 x d, "d" fiind inversul factorului de diluţie cel mai slab.
8.1.4. Cînd toate numărările sînt mai mari de 300 şi cînd numărarea este posibilă, se procedează la o estimare şi la multiplicarea prin inversul factorului de diluţie. Se exprimă rezultatul cu indicaţia "numărul estimat de microorganisme pe ml".
8.2. Lapte UHT şi lapte sterilizat.
Conţinuturile în germeni mai mari de 10 colonii pe 0,1 ml sînt considerate ca necorespunzătoare.
CAPITOLUL 5.
NUMĂRAREA MICROORGANISMELOR DIN LAPTE PRIN METODA DE
NUMĂRARE A COLONIILOR OBŢINUTE LA 21oC
1. Obiect şi domeniu de activitate
Prezentul capitol descrie procedeul de numărare a microorganismelor prin tehnica numărării coloniilor obţinute la 21oC, din lapte preincubat timp de cinci zile la 6oC, în vederea stabilirii contaminării lui cu microorganisme psihotrope capabile să se multiplice în lapte Ia 6oC.
Procedeul descris reprezintă metoda de referinţă.
2. Definiţie
Prin "microorganisme" se înţeleg toate organismele care formează colonii numărabile după o incubare în aerobioză în condiţiile de lucru descrise.
3. Principiu
Incubarea laptelui pasteurizat la 6oC timp de cinci zile. Amestecarea unui volum determinat din eşantionul de lapte preincubat cu mediul de cultură în cutii Petri la 21oC timp de 25 ore. Numărarea coloniilor şi calcularea numărului de microorganisme pe mililitru de lapte pasteurizat.
4. Aparatură şi veselă
Material curent de laborator.
4.1. Aparatura.
4.1.1. Etuva cu aer cald reglabil la 170o- 175oC.
4.1.2. Autoclav reglabil la 121o\xf11oC.
4.1.3. Etuve reglabile la o temperatură uniformă de:
a. 6o\xf10,2oC
b. 21o \xf1 1oC
4.1.4. pH-metru, cu corecţie de temperatură, sensibil la aproximativ 0,1 unităţi de PH.
4.1.5. Baie de apă reglabilă la 45o\xf11oC.
4.1.6. Lupă cu putere de mărire 2-4x .
4.1.7. Lupă cu putere de mărire 8-10x .
4. l .8. Numărător de înregistrare.
4.1.9. Agitator capabil de a amesteca 1 ml de eşantion de lapte sau de o diluţie zecimală cu 9 ml diluant, şi al cărui principiu de funcţionare se bazează pe o  mişcare de rotaţie excentrică a conţinutului tubului de testare.
4.2. Vesela.
4.2.1. Tuburi de testare, cu dopuri corespunzătoare, de capacitate corespunzătoare pentru a conţine, cu un spaţiu suficient ce permite o agitare convenabilă. 10 ml din prima diluţie sau din diluţiile zecimale următoare.
4.2.2. Flacoane de 150-250 ml capacitate sau tuburi de aproximativ 20 ml capacitate, pentru a conţine mediul de cultură.
4.2.3. Pipete (cu dop de vată) de sticlă sau din material sintetic sterile, neştirbite, cu o capacitate nominală de 1 ml, cu un orificiu de scurgere de 1,75-3 mm diametru.
4.2.4. Cutii Petri de sticlă sau de material sintetic sterile, transparente incolore, fundul cutiilor avînd un diametru interior în jur de 90-100 mm. Adîncimea interioară trebuie să fie de cel puţin 10 mm. Fundul nu trebuie să prezinte nici o neregularitate susceptibilă de a jena numărarea coloniilor.
4.2.5. Sterilizarea sticlăriei.
a) la etuva cu aer cald (4.1.1.) la o temperatură de 170o-175oC timp de cel puţin o oră;
b) la autoclav cu aer cald (4.1.2.) la o temperatură de 121o\xf11oC timp de cel puţin 20 minute.
În autoclav trebuie luată orice precauţie pentru a asigura o penetraţie corespunzătoare a vaporilor: dacă materialul este sterilizat în recipiente, acestea nu trebuie să fie închise ermetic, dopurile sau capacele flacoanelor trebuie să fie slăbite.
Se usucă sticlăria sterilizată în autoclav pentru a se elimina vaporii.
Pipetele trebuie să fie sterilizate la etuva cu aer cald (4.1.1.).
5. Mediul de cultură pentru numărarea germenilor din lapte în placa cu geloză
5.1. Compoziţie:
Extract de drojdie        2,5 g
Triptonă           5,0 g
D(+) Glucoza sau dextroza     1,0 g
Lapte praf degresat      1,0 g
Agar-agar          10-15 g în funcţie de proprietăţile
          gelifîante ale agarului
Apă           1000 ml
Laptele-praf degresat trebuie să fie lipsit de substanţe inhibitoare, ceea ce se va verifica prin teste comparative, realizate folosind un lapte praf degresat recunoscut a fi lipsit de asemenea substanţe.
Preparare:
Se pune în suspensie dizolvînd în apă, în ordine, extractul de levuri, triptonă, glucoza şi apoi laptele praf degresat. Operaţiunea este mai uşoară dacă suspensia este încălzită. Se adaugă apoi agar-agarul şi se fierbe agitînd frecvent pînă la dizolvarea completă a agar-agarului sau se încălzeşte la vapori timp de 30 minute aproximativ.      
Se filtrează prin hîrtie de filtru, dacă este necesar.
Se verifică pH-ul cu ajutorul pH-metrului (4.1.4.). Dacă este necesar se ajustează pH-ul folosind o soluţie (de cel puţin 0,1 mol/l) de hidroxid de sodiu sau de acid clorhidric în aşa fel ca, după sterilizare, să fie 6,9\xf10,1 la 25oC.
5.2. Repartizarea, sterilizarea şi conservarea mediului de cultură.
Se repartizează mediul de cultură (5.1.) în cantităţi de 100-150 ml în flacoane sau de 12-15 ml în tuburi (4.2.2.). Se pun dopurile la flacoane şi tuburi. Se sterilizează la autoclav (4.1.2.) la 121o\xf11oC timp de 15 minute. Se verifică pH-ul mediului.
Dacă mediul de cultură nu se foloseşte imediat, se păstrează la adăpost de lumină între 1o şi 5o C timp de o lună maxim de la preparare.
5.3. Mediul de cultură complet deshidratat din comerţ.
Mediul de cultură (5.1.) poate fi preparat dintr-un mediu de cultură complet deshidratat vîndut în comerţ. Se urmează instrucţiunile fabricantului, dar se adaugă lapte- praf degresat înainte de dizolvare, dacă el nu intră în compoziţia produsului.
Se ajustează pH-ul la 6,9 \xf1 0,1 la 25oC după modelul descris la 5.1., apoi se repartizează, se sterilizează şi se stochează mediul conform indicaţiilor date la 5.2.
6. Diluanţi
6.1. Soluţie de peptonă/sare.
Compoziţie:
Peptonă        1,0 g
Clorura de sodiu (NaCl)   8,5 g
Apa         1000 ml
Preparare:      
Se dizolvă componentele în apă, încălzind dacă este necesar.
Se verifica pH-ul cu ajutorul unui pH-metru (4.1.4.) şi dacă este necesar, se ajustează pH-ul utilizînd o soluţie (de cel puţin 0,1 mol/l) de hidroxid de sodiu sau de acid clorhidric astfel încît după sterilizare să fie 7,0\xf10,1 la 25oC.
6.2. Repartizarea, sterilizarea şi conservarea diluantului.
Se repartizează diluantul (6.1.) în tuburi de testare (4.2.1.) într-o cantitate încît fiecare tub să conţină, după sterilizare, 9,0 \xf1 0,2 ml de diluant. Se pun dopurile la tuburi.
Se sterilizează la autoclav (4.1.2.) la 121o \xf1 1oC timp de 15 minute. Se verifică pH-ul diluantului. Dacă diluantul nu se utilizează imediat, se păstrează la adăpost de lumină la 1o-5oC timp de o lună maximum de la preparare.
6.3. Diluanţi complet deshidrataţi din comerţ.
Prepararea diluantului (6.1.) se poate face cu pudră sau comprimate deshidratate vîndute în comerţ. Se urmează instrucţiunile fabricantului. Se ajustează pH-ul după modul descris la 6.1., apoi se repartizează, se sterilizează şi se stochează diluanţii conform instrucţiunilor date la 6.2.
7. Mod de lucru
7.1. Topirea mediului.
Înainte de a începe examenul microbiologic, se topeşte rapid cantitatea de mediu necesar şi se răceşte mediul la 45o\xf11oC într-o baie de apă (4.1.5.).
7.2. Prepararea eşantionului de lapte.
7.2.1. Se incubează laptele pasteurizat în ambalajul închis sau, dacă aceasta nu este posibil, eşantionul reprezentativ de cel puţin 100 ml, timp de 120\xf12 ore la 6o\xf10,5oC într-o etuvă (4.1.3.a.)
7.2.2. După incubare, se amestecă convenabil eşantionul de lapte pentru a obţine o repartizare a microorganismelor cît mai omogenă posibil, răsturnînd rapid de 25 ori recipientul care conţine eşantionul. Se evită formarea de spumă sau se lasă ca spuma să se disperseze. Timpul între amestecarea şi prelevarea prizei de testat nu trebuie să depăşească 3 minute.
7.3. Prepararea primei diluţii( 10-1).
Se transferă, cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.3.) 1 ml de eşantion (7.2.2.) în 9 ml de diluant (6.1.) evitîndu-se orice contact între pipetă şi diluant. Temperatura diluantului trebuie să fie aceeaşi cu cea a eşantionului. Se amestecă cu grijă această primă diluţie cu ajutorul unui agitator (4.1.9.) timp de 5-10 secunde.
Se obţine astfel o primă diluţie 10-1.
7.4. Prepararea diluţiilor zecimale următoare. Se transferă, cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.3.), 1 ml din prima diluţie (7.3.) în 9 ml de diluant (6, 1.) urmînd indicaţiile date la 7.3.
Se obţine astfel diluţia I0-2.
Se repetă aceste operaţiuni pentru a obţine diluţiile zecimale următoare pînă la obţinerea numărului adecvat de microorganisme (8.1.).
7.5. Inocularea cutiilor Petri.
Se transferă, cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.3.), 1 ml de eşantion sau din diluţiile zecimale corespunzătoare într-o cutie (4.2.4.). Analiza trebuie să se facă la cel puţin două diluţii. Se prepară, pentru fiecare diluţie, două cutii selecţionate convenabil (8.1.).
7.6. Turnarea mediului.
Se varsă în jur de 15-18 ml de mediu (7.1.) în fiecare cutie însămînţată.
Se amestecă imediat prin rotaţia cutiei Petri pentru obţinerea unei repartizări regulate a coloniilor după incubare.
Timpul între terminarea pregătirii eşantionului şi amestecarea diluţiei cu mediul nu trebuie să depăşească 15 minute.
Se lasă în repaus pe o suprafaţă orizontală rece şi curată.
7.7. Incubarea cutiilor Petri.
Se aşează cutiile în etuvă (4.1.3b). Se incubează cutiile răsturnate. Nu se stivuiesc mai mult de şase. Stivele de cutii nu trebuie să se atingă, nici să fie în contact cu pereţii şi partea superioară a etuvei.
Se incubează la 21o\xf11oC timp de 25 ore.
7.8. Numărarea coloniilor.
Se efectuează numărarea coloniilor din cutiile Petri care nu conţin mai mult de 300 colonii. Se examinează cutiile la lumina atenuată. O lupă (4.1.6.) şi/sau un numărător cu înregistrare (4.1.8.) pot fi utilizate pentru a uşura numărarea. Se evită confundarea particulelor de materii precipitate cu coloniile de talia gămăliei unui ac. În caz de dubiu, se procedează la un examen minuţios folosind, dacă este necesar, o lupă cu putere de mărire superioară (4.1.7.), pentru a deosebi coloniile de materialele străine.
Coloniile invadante se consideră drept colonii unice. Dacă coloniile invadante acoperă mai puţin de un sfert din cutie, se numără coloniile din partea neatinsă a cutiei şi se calculează numărul corespunzător pentru cutia întreagă. Dacă coloniile invadante acoperă mai mult de un sfert din cutie, se elimină cutia.
8. Calculul şi exprimarea rezultatelor
8.1. Se utilizează rezultatele cutiilor care conţin între 10 şi 300 colonii (a se vedea 8.3 şi 8.4.).
8.2. Se calculează numărul de microorganisme pe ml de lapte pasteurizat cu ajutorul formulei următoare:
SC/ml =         SC    
         (n1 +0,1 n2)d
în care:      
SC  - este suma totală a coloniilor numărate conform 8.1.
(n1 + 0,1 n2)d - este egal cu volumul însămînţat în care:  
n1  - este numărul de cutii numărate din prima diluţie,
n2   - este numărul de cutii numărate din a doua diluţie,    
d  - este factorul de diluţie de la care s-a pornit numărarea.
Numărul este rotunjit la două cifre semnificative. Cînd cifra de rotunjit este 5, se rotunjeşte în aşa fel ca cifra imediat din stînga sa fie pară.
Exemplu (lapte pasteurizat):
Diluţia I0-2:  278 şi 290 colonii
Diluţia I0-3:  33 şi 28 colonii
Numărul/ml = 278+290+33+28 = 629 = 28590 = 29000 = 2,9x104
         (2\xf10,1 x 2)10-2      0,022  
8.3. Dacă toate numărările sînt mai mici de 10, se va nota că numărul de microorganisme pe mililitru este mai mic de l0 x d, "d" fiind inversul factorului de diluţie cel mai slab.
8.4. Cînd toate numărările sînt mai mari de 300 şi cînd numărarea este posibilă, se procedează la o estimare şi la multiplicarea prin inversul factorului de diluţie. Se exprimă rezultatul cu indicaţia "numărul estimat de microorganisme pe ml".
CAPITOLUL 6.
NUMĂRAREA COLIFORMILOR DIN LAPTE PRIN METODA DE NUMĂRARE
A COLONIILOR OBŢINUTE LA 30oC
1. Obiect şi domeniu de aplicare
Prezentul capitol descrie procedeul de numărare a coliformilor din laptele pasteurizat prin tehnica de numărare a coloniilor la 30oC care reprezintă metoda de referinţă.
2. Definiţie
Prin coliformi se înţeleg bacteriile care, la 30oC, formează colonii caracteristice sau colonii necaracteristice care fermentează lactoza cu producere de gaz în condiţiile de lucru descrise.
3. Principiu
Amestecarea unui volum determinat din eşantionul de lapte cu mediul de cultură în cutii Petri puse la incubat la 30oC timp de 24 ore, numărarea coloniilor caracteristice şi, dacă este necesar, confirmarea identităţii coloniilor necaracteristice verificînd capacitatea lor de a fermenta lactoza. Apoi calcularea numărului de coliformi pe mililitru de lapte pasteurizat.
4. Aparatură şi veselă
Material curent de laborator:
4.1. Aparatură.
4.1.1. Etuvă cu aer cald, reglabilă la 170o- 175oC.
4.1.2. Autoclav, reglabil la 121o \xf11oC.
4.1.3. Etuva, reglabilă la 30o\xf11oC.
4.1.4. PH-metru, cu corecţie de temperatură, sensibil la 0,1 unitate PH.
4.1.5. Baie de apă, reglabilă la 45o\xf11oC.
4.1.6. Ansă de platină iridată sau de nichel-crom.
4.2. Veselă.
4.2.1. Tuburi de testare, cu dopuri adecvate, aproximativ de 20 ml capacitate în care se pune mediul de confirmare (5.2.) şi clopote Durham de dimensiuni potrivite în vederea utilizării lor în aceste tuburi.
4.2.2. Flacoane de 150-250 ml capacitate în care se pune mediul selectiv solid (5.1.).
4.2.3. Pipete de sticlă sau de material sintetic sterile, neştirbite, cu o capacitate nominală de 1-10 ml cu un orificiu de scurgere de 1,75-3 mm diametru.
4.2.4. Cutii Petri de sticlă sau de material sintetic sterile, transparente şi incolore, fundul cutiei avînd un diametru interior de cca 90-100 mm, înălţimea interioară a cutiei trebuie să fie de 10 mm. Fundul cutiei nu trebuie să prezinte neregularităţi susceptibile de a jena numărarea coloniilor.
4.2.5. Sterilizarea sticlăriei.
Sticlăria trebuie să fie sterilizată prin una din metodele următoare:
a) în etuva cu aer cald (4.1.1.) la o temperatură de 170o-175oC timp de cel puţin o oră;
b) în autoclav (4.1.2.) la o temperatură de 121o\xf11oC timp de cel puţin 20 minute.
În autoclav trebuie luată orice precauţie pentru a asigura o penetraţie corespunzătoare a vaporilor; dacă materialul este sterilizat în recipiente, recipientele nu trebuie să fie închise ermetic, dopurile sau capacele flacoanelor trebuie să fie slăbite.
Se lasă să se usuce sticlăria în autoclav pentru eliminarea vaporilor.
Se sterilizează pipetele în etuva cu aer cald.
5. Medii de cultură
5.1. Geloza lactoză cu cristal violet şi roşu neutru (VRBL - violet red bile lactoze agar). Mediu selectiv solid.
Compoziţie:
Peptonă           7g
Extract de levuri (drojdii)     3 g
Lactoză (C12H22O11*H2O)     10 g  
Clorură de sodiu (NaCl)     5 g
Săruri biliare        1,5 g
Roşu neutru        0,03 g
Cristal violet        0,002 g
Agar-agar          10-15 g (în funcţie de
           proprietăţile gelifiante ale
          agar-agarului).
Apă          1000 ml
Preparare:
Se pun în suspensie, dizolvînd componentele în apă şi se lasă în repaus cîteva minute. Se amestecă apoi energic.
Se verifică pH-ul cu ajutorul pH-metrului (4.1.4.); dacă este necesar, se ajustează pH-ul folosind o soluţie (de cel puţin 0,1 mol/l) de hidroxid de sodiu sau de acid clorhidric, astfel încît, după fierbere, el trebuie să fie 7,4\xf10,1 la 25oC.
Se pune imediat la fierbere agitîndu-se din timp în timp şi se repartizează imediat mediul în cantităţi de 100-150 ml în flacoane sterile (4.2.2.). Se răceşte mediul la 45o\xf11oC într-o baie de apă (4.1.5.).
Se controlează sterilitatea mediului în momentul folosirii (a se vedea 6.4.).
Se utilizează mediul în următoarele 3 ore de la preparare.
5.2. Bulion lactozat cu verde briliant. Mediu de confirmare
Compoziţie:
Peptonă  10 g
Lactoză (C12H22O1I-H20) 10 g
Bila de bou deshidratată 20 g
Verde briliant  0,0133 g
Apă   1000 ml
Preparare:
Se dizolvă componentele în apă, aducîndu-se la fierbere.
Se verifică pH-ul cu ajutorul unui pH-metru (4.1.4.) şi se ajustează, dacă este necesar, pH-ul cu ajutorul unei soluţii (cel puţin 0,1 mol/l) de hidroxid de sodiu sau de acid clorhidric, astfel încît, după sterilizare, să fie de 7,2 \xf1 0,1 la 25oC.
Se repartizează mediul, în cantităţi de 10 ml, în tuburi de testare (4.2.1.) cu clopote Durham. Se pun dopurile la tuburi.
Se sterilizează la autoclav (4.1.2.) la 121o \xf11oC timp de 15 minute.
Clopotele Durham nu trebuie să conţină bule de aer după sterilizare.
Se verifică pH-ul mediului.
Dacă mediul nu se utilizează imediat, se păstrează la adăpost de lumină între 0o şi 5oC timp de maxim o lună după preparare.
5.3. Medii de cultură complete dehidratate din comerţ. Mediile de cultură (5.1., 5.2.) pot fi preparate cu ajutorul mediilor complete deshidratate vîndute în comerţ. Se urmează instrucţiunile fabricantului. Se ajustează pH-ul, se repartizează, se fierb sau se sterilizează şi se stochează mediile după indicaţiile date la 5.1. şi 5.2.
6. Mod de lucru
6.1. Mediul.
Se utilizează mediul (geloza VRBL) descris la 5.1.
6.2. Prepararea eşantionului de lapte.
Se agită viguros eşantionul de lapte pentru obţinerea unei repartizări a microorganismelor cît mai omogene posibil, răsturnînd rapid de 25 ori recipientul ce conţine eşantionul. Se evită formarea spumei sau se lasă spuma să se disperseze. Timpul între amestecarea şi prelevarea prizei de testat nu trebuie să depăşească 3 minute.
6.3. Însămînţarea cutiilor Petri.
Se însămînţează 3 ml din eşantionul de lapte (6.2.) transferînd, cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.3.), un ml de eşantion în fiecare din cele trei cutii (4.2.4.).
6.4. Turnarea mediului.
Se toarnă geloza VRBL (6.1.) în fiecare cutie însămînţată aproximativ 12 ml.
Se amestecă imediat geloza, prin rotirea cutiei Petri, pentru obţinerea unei repartizări regulate a coloniilor după incubare.
Timpul între pregătirea eşantionului şi amestecarea prizei de testare cu mediul nu trebuie să depăşească 15 minute.
Pentru a controla sterilitatea, se pregăteşte o cutie- martor cu 12 ml geloză VRBL folosită pentru cutiile însămînţate.
Se lasă în repaus pe o suprafaţă orizontală şi curată pînă la solidificarea mediului.
După solidificarea completă a mediului, se toarnă cel puţin 4 ml geloza VRBL (6.1.) pe suprafaţa mediului însămînţat.
Se lasă să se solidifice.
6.5. Incubarea cutiilor Petri.
Se aranjează cutiile în etuvă (4.1.3.). Se incubează cutiile răsturnate. Nu se suprapun mai mult de şase. Stivele de cutii nu trebuie nici să atingă, nici să fie în contact cu pereţii şi partea superioară a etuvei. Se incubează la 30o\xf1 1oC timp de 24\xf12 ore.
6.6. Numărarea coloniilor.
6.6.1. Se numără coloniile din cutiile Petri care nu conţin mai mult de 150 colonii. Se numără coloniile roşii - închise cu diametrul de cel puţin 0,5 mm cu sau fără precipitat în jur, caracteristice coliformilor.
6.6.2. Dacă toate sau unele colonii au un aspect necaracteristic (divergenţa de culoare, de mărime sau de formare a precipitatului în comparaţia cu coloniile tipice), se aplică proba de confirmare (6.7.).
6.7. Proba de confirmare.
După indicaţiile date la 6.6.2., se aplică proba de confirmare pe un număr convenabil de colonii (de exemplu 3-5) necaracteristice însămînţîndu-le în tuburi cu bulion lactozat cu bilă şi verde briliant (5.2.) cu ajutorul unei anse buclate (4.1.6.). Se incubează tuburile la 30o \xf1 IoC timp de 24\xf12 ore.
Coloniile care produc gaz în clopotele Durham se consideră ca fiind coliforme.
7. Calcularea şi exprimarea rezultatelor
7.1. Se reţin pentru numărare (a se vedea 7.4.) cutiile ce conţin maxim 150 colonii.
7.2. Dacă se procedează la proba de confirmare, se calculează numărul de colonii de coliformi pornind de la procentul coloniilor de coliformi confirmate.
7.3. Se calculează numărul de coliformi pe ml de lapte pasteurizat cu ajutorul formulei următoare:
SC/ml =        SC    
             (n1+0,1n2)d
în care:
SC este suma totală a coloniilor coliforme (7.1. în relaţie cu 7.2.) găsite la analiza eşantionului de lapte (3 ml).
Numărul se rotunjeşte la două cifre semnificative dacă sînt mai mult de 100 colonii. Cînd cifra de rotunjit este 5, se rotunjeşte astfel ca cifra plasată imediat la stînga să fie pară.
Dacă toate numărările sînt mai mari de 150 colonii, rezultatul obţinut se exprimă cu indicaţia "numărul estimat de coliformi pe ml".
CAPITOLUL 7.
NUMĂRAREA CELULELOR SOMATICE DIN LAPTELE CRUD
PRIN PROCEDEUL MICROSCOPIC
1. Obiect şi domeniu de aplicare
Prezentul capitol descrie procedeul de determinare a numărului real de celule somatice din laptele crud prin procedeul microscopic. Acest procedeu reprezintă metoda de referinţă şi serveşte, în acelaşi timp, pentru etalonarea şi verificarea preciziei procedeului fluorooptoelectronic.
2. Definiţie
În sensul prezentei norme sanitare veterinare, prin celule somatice se înţeleg celulele, de exemplu leucocitele şi celulele epiteliale, al căror nucleu poate fi colorat distinct cu albastru de metilen.
3. Principiu
Etalarea a 0,01 ml lapte pe suprafaţa unui cm2 al unei lame port-obiect. Suprafaţa de lapte se usucă şi se colorează. Numărarea se efectuează cu ajutorul unui microscop. Numărul de celule somatice numărate pe o suprafaţă determinată se multiplică cu un factor de multiplicare pentru obţinerea numărului de celule pe ml.
4. Reactivi
Produsele chimice trebuie să fie de calitate analitică.  
Soluţie colorantă.
Compoziţie:
Albastru de metilen        0,6 g
Etanol - 99%           54,6ml
1, 1,1 - triclor-etan sau tetracloretan   40,6 ml
Acid acetic glacial           6,6 ml
Atenţie!
Tetraclor-etanul fiind toxic, manipulările trebuie să fie făcute sub o hotă aspirantă.
Preparare:
Se amestecă etanolul şi 1, 1,1-triclor-etanul într-un flacon şi se încălzeşte într-o baie de apă la 60-70oC. Se adaugă albastrul de metilen, se amestecă cu grijă, se răceşte la 4oC timp de 12-24 ore, apoi se adaugă acidul glacial. Se filtrează printr-un filtru cu porozitate de 10-12 microni maxim şi se păstrează soluţia colorantă într-un flacon etanş: în cazul formării particulelor de sediment, se filtrează din nou înainte de utilizare.
5. Aparatură şi veselă
5.1. Microscop ce permite o mărire de x 500 pînă la x 1000.
5.2. Microseringa ce permite repartizarea cantităţilor de 0,01 ml cu o precizie de 2% sau mai mare.
5.3. Lama port-obiect pentru etalarea filmului cu un dreptunghi gravat de 20 mm x 5 mm sau lama standard şi gabarit de 20 mm x 5 mm.
5.4. Placa încălzitoare orizontală (30o-50oC) pentru uscarea lamelor.
5.5. Ventilator (tip de uscat părul) pentru uscarea filmului.
5.6. Baie de apă, reglabilă la 30o- 40oC pentru încălzirea probei de lapte.
5.7. Micrometru obiectiv gradat la 0,01 mm.
6. Mod de lucru
6.1. Eşantion de lapte.
Eşantionul de lapte trebuie să fie analizat în primele şase ore de la prelevare. În timpul stocării, temperatura eşantionului nu trebuie să depăşească 6oC. Congelarea trebuie evitată.
6.2. Pregătirea eşantionului în laborator. Se încălzeşte într-o baie de apă (5.6.) la 30o- 40oC, apoi se amestecă cu grijă. Se răceşte la temperatura la care a fost etalonată microseringa (5.2.), de exemplu 20oC.  
6.3. Pregătirea lamelor. Se spală lamele (5.3.) cu etanol, de exemplu, se şterg cu o hîrtie care nu lasă particule, se flambează şi se lasă să se răcească. Se păstrează într-o cutie la adăpost de praf.
6.4. Prepararea filmului.
Cu ajutorul microseringii (5.2.) se ia 0,01 ml din eşantionul de lapte preparat cum s-a arătat mai sus.
Se şterge cu grijă partea externă a vîrfului seringii intrat în contact cu laptele. Se depune conţinutul seringii pe lamă (5.3.) după ce s-au delimitat contururile dreptunghiului (20 mm x 5 mm). Se repartizează apoi priza cît mai regulat posibil pe această suprafaţă. Se lasă să se usuce filmul pe o placă încălzitoare orizontală (5.4.) pînă la uscarea completă.
Se prepară şi se examinează cel puţin două filme din fiecare eşantion.
6.5. Colorarea filmelor.
Se cufundă într-o soluţie colorantă (4.) timp de 10 minute. Se usucă şi, dacă este necesar, se completează uscarea cu ajutorul unui ventilator (5.5.).
Se cufundă filmele în apă pînă la eliminarea completă a surplusului de colorant. Se usucă din nou şi se păstrează ferite de praf.
6.6. Etalonarea cîmpului microscopic.
Alegîndu-se puterea de mărire de (x 500-x l000), se măsoară cu ajutorul micrometrului obiectiv (5.7.) diametrul cîmpului microscopic.    
7. Numărare şi calcul
7.1. Numărarea celulelor.
Se foloseşte microscopul (5.1.). În locul numărării celulelor, se numără numai nucleele celulelor, uşor de recunoscut şi din care cel puţin jumătate se văd în cîmpul microscopic. Se numără benzile sau cîmpurile situate în treimea centrală a filmului, evitîndu-se numărarea benzilor sau cîmpurilor din zonele periferice ale filmului. Atenţia acordată preparării filmelor şi, deci, fiabilitatea rezultatelor trebuie să fie verificate cel puţin o dată pe lună numărînd diferite părţi ale filmului. De asemenea, este la fel de posibil de a face numărarea numărînd cîmpurile microscopice repartizate astfel încît să fie reprezentate toate părţile filmului în mod egal.
7.2. Determinarea numărului minim de celule de numărat.
Dat fiind faptul că numărarea microscopică a celulelor somatice poate de asemenea fi folosită pentru etalonarea tehnicilor de numărare mecanică şi automatică, coeficientul de variaţie a numărărilor pe eşantioane identice nu trebuie să fie mai mare decît cel obţinut cu aparatele electronice. Coeficientul de variaţie pentru un eşantion de lapte care conţine 400 000 - 600 000 celule pe ml nu trebuie să depăşească 5%.
După legea de distribuţie a lui Poisson, pentru obţinerea acestei repetabilităţi, numărul de celule somatice ce urmează a fi numărate din fiecare eşantion nu trebuie să fie mai mic de 400.
Legea de distribuire a lui Poisson presupune după formula: M = V = S1
Unde: M este valoarea medie aritmetică.
V este variaţia
S1 este tipul de deviaţie
Coeficientul de variaţie este: CV=S x 100%
                       M  
sau CV=100% sau CV=100%  ,
           S                  V_________________
                                                                                     M
unde: M (media) reprezintă numărul de particule(celule) care au fost inventariate ( de exemplu, 400 pentru CV = 5%).
7.3. Calcularea factorului de multiplicare.
Folosind 0,01 ml lapte, factorul de multiplicare se calculează conform punct. 7.3.1.
7.3.1. Numărarea benzilor filmului.
Lungimea benzilor de numărat este de 5mm, adică lăţimea filmului. Lăţimea benzii corespunde cu diametrul cîmpului microscopic determinat cu micrometrul obiectiv (5.7.).
Factorul de multiplicare (WF) = 200 x 100
                   d x b
unde:
d este diametrul în milimetri al cîmpului microscopic, determinat cu micrometrul obiectiv (5.).
b este numărul de benzi numărate complet.
7.4. Calculul conţinutului de celule.
Numărul celulelor somatice numărate (7.1. şi 7.2.) se înmulţeşte cu factorul de multiplicare (7.3.), pentru obţinerea numărului de celule pe ml lapte.
7.5. Precizie.
Coeficientul de variaţie al repetabilităţii (a se vedea 7.2.) nu trebuie să depăşească 5%. Nu se dispune de nici un rezultat de testare circulară recunoscut internaţional în materie de precizie.
CAPITOLUL 8.
DETECTAREA ANTIBIOTICELOR ŞI SULFAMIDELOR
1. Obiect şi domeniu de aplicare
Prezentul capitol descrie metoda de detectare a antibioticelor şi sulfamidelor din laptele crud şi din laptele tratat termic. Această metodă reprezintă metoda de referinţă.
Metoda comportă:
A. Un procedeu calitativ
Acesta este procedeul iniţial ce permite selectarea probelor care conţin antibiotice şi/sau sulfamide şi se bazează pe folosirea unei tulpini de Bacillus stearothermophilus, varietatea calidolactis, ATCC 10149 ca organism test. Procedeul este considerat reprezentativ pentru testele de detectare.
B. Un procedeu de confirmare şi de identificare a penicilinei.
Acest procedeu trebuie să fie folosit pentru confirmarea rezultatelor "procedeului A", de identificare a penicilinei şi de a-i determina concentraţia.
A. PROCEDEUL CALITATIV
1. Obiect şi domeniu de aplicare
Acest procedeu descrie tehnica de detectare a antibioticelor şi sulfamidelor în laptele crud şi laptele tratat termic în concentraţii superioare limitelor menţionate în tabelul1)1:
Tabelul 1
Denumirea antibioticului            Limita de detecţie
                Negativ    Pozitiv
Benzilpenicilina  0,002  0.006
Ampicilina  0,002  0,005
Cloxacilina  0,015  0,035
Nafcilina  0,006  0,011
Tetraciclină hidroclorică  0,10  0,40
Oxitetracicline  0,20  0,45
Clortetracicline  0,15  0,50
Cloramfenicol  7  15
Dihidrostrepîomicina  4  13
Neomicina  1  22
Kanamicina  9  28
Bacitracina  0,06  0,14
Eithromicina  1  2,25
Rifamicina  0,01  0,14
Diafenilsufona  0,01  0,1
Sulfamctazina (sulfadimidina)  0,5  1
1)Benzilpenicilina şi bacitracina sînt exprimate în UI/ml, toate celelalte - în mg/ml.
2.Definiţie
Laptele conţine antibiotice sau sulfamide cînd culoarea mediului rămîne neschimbată (a se vedea 7.1.).
3. Principiu
Adăugarea eşantionului de lapte şi a amestecului nutritiv într-o geloză care conţine un indicator de PH şi spori de Bacillus stearothermophilus, varietate calidolactis, ATCC 10149 (vezi 5.4.1.), tulpina care prezintă, într-un mod general, o foarte bună sensibilitate şi, mai ales, pentru penicilină. O creştere normală şi producere de acid de către acest organism după incubare provoacă o schimbare a culorii indicatorului de PH care virează de la purpurie la galben. Cînd laptele conţine substanţe inhibitoare pentru creşterea microorganismelor test, culoarea indicatorului de PH rămîne purpurie.
4. Aparatură şi veselă
Materialele curente de laborator.
4.1. Aparatura.
4.1.1. Etuva reglabilă la 64oC\xf11oC.
4.1.2. Baie de apă reglabilă de 64oC\xf1IoC.
4.1.3. Stativ pentru eprubete sau fiole.
4.1.4. Seringă cu ace de unică folosinţă ce permite repartizarea a 0,1ml.
4.1.5. Penseta.
4.1.6. Etuvă de sterilizare cu aer cald, reglabilă la 170o-175oC.
4.1.7. Autoclav reglabil la 121o\xf11oC.
4.1.8. pH-metru .  
4.2. Veselă.    
4.2.1. Flacoane pentru eşantioane cu închidere automată.
Notă: Unele dopuri de cauciuc pot depozita substanţe inhibitoare la locul de închidere a flaconului.
4.2.2. Cutii Petri din material sintetic sterile sau de sticlă incoloră transparentă, cu diametrul interior de cca 14 mm, cu fundul perfect plat.
4.2.3. Flacoane de 250 ml.
4.2.4. Pipete (cu dop de vată) de sticlă sau material sintetic cu o capacitate nominală de 1 ml şi 10 ml.
4.2.5. Spatule de sticlă.
4.2.6. Eprubete sau fiole cu capac sau dop, cu diametrul interior de cca 8 mm.
4.2.7. Sterilizarea veselei.
Sticlăria trebuie sterilizată prin una din următoarele metode:
a) în etuve cu aer cald la 170o-175oC timp de cel puţin o oră (4.1.6.);
b) în autoclav la o temperatură de 121oC timp de cel puţin 20 de minute (4.1.7.).
În autoclav trebuie luată orice precauţie pentru asigurarea unei penetraţii adecvate a vaporilor: dacă materialul este sterilizat în recipiente, acestea nu trebuie închise ermetic, dopurile sau capacele fiolelor trebuie să fie slăbite. Se lasă să se usuce sticlăria sterilizată în autoclav pentru a elimina vaporii. Pipetele se sterilizează în etuve cu aer cald.
5. Medii, soluţii, microorganisme test
Componentele de bază ale mediilor trebuie să fie potrivite pentru analizele bacteriologice. Apa folosită trebuie să fie apă distilată în aparate de sticlă sau apă demineralizată de puritate echivalentă. Ea trebuie să fie lipsită de substanţe care pot inhiba creşterea microorganismelor test.
5.1. Medii.
5.1.1. Geloză nutritivă.
Compoziţie:
Extract de levuri.........2 g
Peptona.................... 5 g
Extract de carne........ 1 g
Clorură de sodiu.........5 g
Agar...........................10-15 g
Apă distilată................1000 ml
Preparare:
Se dizolvă componentele în apă. Se încălzeşte pînă la fierbere agitînd din cînd în cînd. Se ajustează pH astfel încît, după sterilizare, să fie 7,4\xf10,1 la 25oC.
Se repartizează cîte 10 ml în eprubete sau cîte 100 ml în flacoane şi se înclină pentru a obţine o pantă. Se sterilizează 15 minute la 121oC.
5.1.2. Mediu gelozat.
Clorura de sodiu............2g
Agar .............................15 g
Apă...............................1000 ml
Soluţie de trimetoprim sau de tetroxoprim (vezi 5.1.3.) 10 ml
Preparare:    
Se dizolvă componentele în apă cu excepţia trimetoprimului sau tetroxoprimului. Se conduce la fierbere, agitîndu-se din cînd în cînd. Se adaugă trimetoprimul sau tetroxoprimul şi se sterilizează 15 minute la 121oC. Se ajustează pH-ul, astfel încît, după sterilizare, să fie 7,0\xf1 0,1 la 25oC.
5.1.3. Soluţia de trimetoprim sau de tetroxoprim.
Compoziţie.
Trimetoprim ..................5 mg sau tetroxoprim.....30 mg
Etanol de 96o ................5 ml sau respectiv ........ 30 ml
Apă ............................. pînă la 1000 ml
Preparare:
Se dizolvă trimetoprimul sau tetroxoprimul în etanol (5 sau 30 ml) şi se completează cu apă.
5.1.4. Amestec nutritiv:
Compoziţie.
Extract de levuri...................0,75 mg  
Glucoza.............................. 5,0 mg
Amidon solubil.................... 8,0 mg
Purpur de bromcresol ......... 0,025 g
Apă ..................................  50 ml
Preparare:    
Se dizolvă amestecul nutritiv şi indicatorul în apă prin încălzire, dacă este necesar, şi se sterilizează prin filtrare. Amestecul nutritiv se vinde în comerţ sub formă de comprimate.
5.2. Soluţii-etalon de penicilină.  
5.2.1. Se prepară, într-un flacon steril, cu închidere adecvată, o soluţie de penicilină de 60 mg/ml = (100 Ul/ml) dizolvînd 60 mg benzilpenicilinat de sodiu sau de potasiu în 100 ml apă distilată sterilă.
5.2.2. Se prepară o soluţie diluată de penicilină introducînd 1,25 ml soluţie de penicilină (5.2.1.) în apă distilată şi se completează la 1000 ml. Această soluţie diluată conţine 0,075 mg penicilină/ml (=0,125 UI/ml).
5.2.3. Se prepară 75 ml soluţie etalon de penicilină care conţine 0,004 mg penicilină/ml (=0,0067 Ul/ml), adăugînd 4 ml soluţie diluată de penicilină (5.2.2.) la 71 ml lapte lipsit de substanţe inhibitoare (5.3.) şi se amestecă.
5.2.4. Soluţiile de penicilină descrise la 5.2.1. pînă la 5.2.3. trebuie să fie folosite imediat în ziua preparării lor.
5.3. Laptele lipsit de substanţe inhibitoare.
Se prepară un lapte martor lipsit de substanţe inhibitoare dizolvînd în apa distilată sterilă, lapte-praf degresat (10% m/v), verificat în prealabil la absenţa substanţelor inhibitoare. Se poate folosi, de asemenea, o cantitate de lapte proaspăt de amestec la care s-a verificat absenţa substanţelor inhibitoare; acest lapte se va repartiza în flacoane, încălzit timp de l oră la 100oC, apoi conservat la 0-6oC timp de maximum o săptămînă.
5.4. Microorganisme test.
5.4.1. Bacilluş stearothermophilus, variaţia calidolactis, tulpina ATCC 10149 se foloseşte ca microorganism test. Tulpina 10149 este identică cu tulpina C 953.
5.4.2. Se prepară o cultură de rezervă din cultura de lucru pentru conservarea culturii. Conservarea se face pe geloză nutritivă înclinată (5.1.1.). Geloza înclinată se însămînţează în strii cu ajutorul unei anse impregnate cu cultura de lucru, apoi se incubează în aerobioză timp de 48 ore la 63o\xf11oC. După incubare, tubul se închide ermetic cu ajutorul unui dop de cauciuc steril. Cultura de rezervă astfel obţinută poate fi păstrată mai multe luni la frigider la 5oC.
5.5. Cultura de lucru (suspensia de spori).
5.5.1. Se toarnă aseptic 20 ml geloză nutritivă topită (5.1.1.) într-o cutie Petri (4.2.2.) sterilă şi se lasă să se răcească la temperatura ambiantă.
5.5.2. Cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.4.), se transferă 5 ml de apă distilată sterilă într-un tub care conţine cultură de rezervă (5.4.2.) şi se iau, prin spălare, sporii de pe suprafaţa gelozei nutritive înclinate, ajutîndu-ne de o ansă sterilă. Suspensia de spori se păstrează la 5oC şi se foloseşte în următoarele 36 ore.
5.5.3. Cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.4.), se transferă 5 ml din suspensia de spori (5.5.2.) într-o cutie Petri care conţine mediul (5.5.1.) şi se etalează cu grijă inoculul pe toată suprafaţa cu un etalor de sticlă. Se incubează la 63o\xf11oC (4.1.1.) timp de 16-18 ore.
Dintr-o cultură de rezervă (5.4.2.) sau o cultură care are mai mult de 36 ore, tehnica de repicare va trebui efectuată cel puţin de două ori la interval de maxim 36 ore între culturi.
5.5.4. Se transferă, cu ajutorul unei pipete sterile (4.2.4.), 10 ml de apă distilată în cutia care conţine cultură (5.5.3.) şi se antrenează sporii de pe suprafaţă în suspensie, cu ajutorul unei baghete de sticlă.
Se transferă suspensia de spori într-un flacon (4.2.3.) care conţine 250 ml apă distilată. Se închide flaconul şi se agită viguros. Culturile care nu se replică imediat trebuie conservate la frigider la 0o-6oC.
5.5.5. Suspensia de spori însămînţată pe mediul gelozat (5.1.2.) lipsit de trimetoprim trebuie să prezinte un număr de germeni viabili între 5 şi 10 milioane/ ml după incubarea la 63o\xf11oC timp de 16-18 ore. Suspensia de spori trebuie să fie uniform de tulbure şi, dacă ea conţine fulgi sau un sediment, se înlocuieşte cu o nouă suspensie preparată din cultura de rezervă (5.4.2.).
5.6. Prepararea tuburilor (fiolelor) de testare.
5.6.1. Se topeşte mediul gelozat (5.1.2.) şi se răceşte la 55oC.
5.6.2. Se adaugă o parte din suspensie de spori proaspeţi (5.5.4.) la cinci părţi de mediu gelozat (5.6.1.) într-un tub sau flacon şi se amestecă cu grijă.
5.6.3. Se transferă într-un tub sau o fiolă sterilă (5.6.2.) 0,3 ml de mediu însămînţat (4.2.6.), calculat pentru a obţine un strat uniform de 5 mm grosime, apoi se închide tubul cu un dop sau cu un capac, iar la fiolă se închide extremitatea la flacără. Se lasă să se solidifice mediul gelozat apoi tuburile sau fiolele se menţin în poziţie verticală timp de cel puţin 12 ore.
5.6.4. Tuburile (fiolele) de testare pot fi utilizate în aceeaşi zi dar, de asemenea, pot fi păstrate timp de mai multe luni la 0o-6oC cu condiţia de a fi răcite imediat după prepararea tor.
6. Modul de lucru
6.1. Eşantioanele trebuie să fie analizate cît mai repede posibil şi de preferinţă în primele 24 ore după prelevare; între timp ele trebuie să fie conservate la 0o-5oC. Dacă nu este posibilă analiza eşantioanelor în cursul primelor 24 ore, se păstrează la congelator (-30oC -15oC) pentru reducerea la minimum a inactivării penicilinei.
6.2. Se identifică fiecare tub (fiolă) lizibil şi de neşters. Se ia dopul sau capacul. Se aşează pe un stativ (4.1.3.) numărul necesar pentru examenul eşantioanelor şi martorilor (5.2. şi 5.3.).
6.3. Se adaugă 50 microlitri din amestecul nutritiv (5.1.4.) în fiecare tub (fiolă).
6.4. Se amestecă cu grijă eşantionul de lapte de analizat şi se transferă, cu ajutorul seringii (4.1.4.), 0.1 ml în tubul sau fiola etichetată. Se foloseşte un ac nou pentru transferul fiecărui eşantion.
6.5. După modul descris la 6.4. se prepară 2 martori cu soluţia etalon de penicilină care conţine 0,004 mg/ml (0.0067 UI(ml) de penicilină.
6.6. După modul descris la 6.4. se prepară 2 martori cu laptele martor lipsit de substanţe inhibitoare (5.3.).
6.7. Se astupă tuburile (fiolele) şi se plasează stativul care conţine tuburile (fiolele) într-o baie de apă reglată la 63o\xf11oC (4.1.2.) timp de cel puţin 2,5 ore.
6.8. Se scoate stativul cu tuburi (fiole) din baia de apă.
6.9. Se observă culoarea mediului gelozat (vezi pct.7).
7. Interpretarea rezultatelor
7.1. O culoare purpurie a mediului gelozat în tuburi (fiole) care conţin soluţia etalon de penicilină sau eşantionul de lapte indică prezenţa antibioticelor sau sulfamidelor la nivelul "pozitiv", indicat în tabelul 1. Sensibilitatea mediului este satisfăcătoare dacă culoarea tuburilor (fiolelor) ce conţin soluţia etalon de penicilină rămîne purpurie.
7.2. O culoare purpurie parţială a mediului gelozat sau o culoare neuniformă în tuburile (fiolele) ce conţin eşantionul de lapte indică prezenţa substanţelor inhibitoare între nivelele vizate în tabelul 1.
7.3. O culoare galbenă a mediului gelozat din tuburile (fiolele) ce conţin laptele martor lipsit de substanţe inhibitoare sau eşantionul de lapte indică absenţa substanţelor inhibitoare pentru microorganismul test.
7.4. Dacă toate tuburile (fiolele) supuse testului, inclusiv martorul negativ, prezintă o culoare purpurie, tuburile (fiolele) nu conţin spori viabili şi eşantioanele trebuie să facă obiectul unei noi analize folosindu-se pentru ansamblul tehnicii elemente proaspăt preparate.
8. Confirmarea rezultatelor
Se confirmă rezultatele tuturor eşantioanelor ce prezintă rezultatele descrise la 7.1. şi 7.2. cu ajutorul "metodei B". Dacă eşantioanele trebuie conservate înainte de confirmare, se recomandă congelarea lor pentru a împiedica degradarea ant-ibioticelor.
B. PROCEDEUL DE CONFIRMARE A PREZENŢEI PENICILINEI
ŞI DETERMINAREA CONCENTRAŢIEI EI
1. Obiect şi domeniu de aplicare
Acest procedeu descrie portretul de confirmare a penicilinelor sau a altor antibiotice, ca şi procedeul de determinare a concentraţiei de penicilină a eşantioanelor de lapte ce prezintă o reacţie pozitivă (A.7.1.) sau dubioasă (A.7.2.).
Sensibilitatea procedeului la diferite antibiotice (vezi A.1).
2. Definiţie
2.1. Eşantionul de lapte conţine antibiotice, inclusiv sulfamide, cînd eşantionul analizat prin metoda descrisă produce o zonă clară de inhibiţie de cel puţin 2 mm în jurul discului.
2.2. Dacă un eşantion care conţine antibiotice, inclusiv sulfamide (2.1.) şi la care se adaugă penicilinaza (betalactamază) nu produce zona clară sau dă o zonă clară cu un diametru mai mic decît cel produs în absenţa penicilinazei, substanţa inhibitoare este fie penicilina, fie penicilina asociată cu un alt antibiotic, inclusiv sulfamide.
2.3. Dacă zona nu este inactivată de penicilinază (2.2.) substanţa inhibitoare prezentă în eşantionul de lapte nu este penicilină dar poate fi un alt reziduu.
Unele peniciline semisintetice, de exemplu cloxacilina sodică, nu sînt sau nu sînt decît în parte inactivate de penicilinază sau sînt rezistente şi nu pot fi identificate ca fiind peniciline (a se vedea 7.3.).
3. Principiu
Un disc de hîrtie absorbantă impregnată cu laptele de analizat se plasează pe suprafaţa unui mediu gelozat însămînţat cu tulpina Bacillus stearothermophilus, varietatea calidolactis. O creştere normală a microorganismului după incubare tulbură mediul gelozat. O zonă clară în jurul discului arată prezenţa în lapte a substanţelor inhibitoare. Dimensiunea zonei clare depinde, printre altele, de concentraţia şi tipul de substanţă inhibitoare prezentă în lapte.
4. Aparatură, veselă şi material
4.1. Aparatură.
4.1.1. Vezi A. 4.1.
4.1.2. Baie reglabilă la 80oC\xf11oC.
4.2. Veselă. Vezi A. 4.2.
4.3. Discuri de hîrtie, lipsite de substanţe inhibitoare, cu diametrul de 9-13 mm, capabile de a absorbi în jur de 130 mg lapte (conservate într-un desecător).
5. Medii, soluţii-etalon, soluţie de penicilinază, reactivi, microorganisme test etc.
Componentele mediilor trebuie să fie proprii analizelor bacteriologice. Apa folosită trebuie să fie apă distilată în aparate de sticlă sau apă demineralizată de puritate echivalentă, lipsită de substanţe care pot inhiba creşterea microorganismelor.
5.1. Medii.
5.1.1. Geloza nutritivă (vezi lit. A. pct.5.1.1.).
5. l .2. Mediu pentru testul de detectare a substanţelor inhibitoare.
Compoziţie.
Extract de levuri ..............2,5 g
Triptona .............................5 g
Glucoza..............................1 g
Soluţie de trimetoprim sau de tetroxoprim (A.5.1.3.).10 ml
Agar-agar.......................... 10 - 15 g (în funcţie de proprietăţile gelifiante)
Apă.................................. l000 ml
Preparare:
Se dizolvă complet componentele solide în apă, încălzind şi agitînd înainte de a adăuga soluţia de trimetoprim sau tetroxoprim. După adăugarea trimetoprimului sau tetroxoprimului, se ajustează pH-ul astfel ca după sterilizare, valoarea lui să fie 8,0\xf10,1 la 25oC. Se sterilizează mediul timp de 15 minute la 121oC \xf1 1oC.
5.2. Soluţii-etalon de penicilină în lapte.
A se vedea lit. A. pct.5.2.
Pentru cuantificarea substanţelor inhibitoare (pct.8) se prepară soluţii etalon de penicilină în lapte lipsit de substanţe inhibitoare (A.5.3.) în concentraţiile următoare:
a) 0,004 mg/ml (0,0067 UI/ml)
b) 0,006 mg/ml (0,01 UI/ml)
c) 0,03 mg/ml (0,05 UI/ml)
d) 0,06 mg/ml (0,1 UI/ml)
5.3. Soluţie de penicilinază.
5.3.1.Se dizolvă o cantitate suficientă de penicilinază (betalactamază) în apă distilată sterilă pentru obţinerea unei concentraţii de 1000 U/ml. Această soluţie de referinţă repartizată în porţiuni mici, se poate stoca la 0-5oC timp de maximum 4 săptămîni.
Notă:
Penicilinaza nu a fost supusă unei standardizări internaţionale.În prezenta metodă se presupune că 10 unităţi penicilinază sînt suficiente să inactiveze 0,6 mg (1 UI) de penicilină. Dacă nu se cunoaşte concentraţia unei anumite penicilinaze, se va verifica dacă supoziţia enunţată mai sus este corectă. Dacă este necesar, se ajustează concentraţia soluţiei de penicilinază.  
5.3.2. În locul unei soluţii de penicilinază, se pot folosi discuri din comerţ impregnante cu penicilinază. În acest caz, se verifică dacă aceste discuri conţin cantitatea necesară de penicilinază.
5.4. Microorganismul test.
Vezi lit. A.5.4.
5.5. Cultura test (suspensia de spori).
Vezi lit. A.5.5.
5.6. Prepararea cutiilor Petri.
5.6.1. Se topeşte pentru testarea detectării substanţelor inhibitoare (5.1.2.), se răceşte la 55oC.
5.6.2. Se adaugă într-un flacon o parte de suspensie de spori proaspeţi (5.5.) la un număr de părţi de mediu pentru testarea detectării substanţelor inhibitoare (5.1.2.) pentru obţinerea densităţii convenabile de colonii în mediul însămînţat şi amestecat bine.
5.6.3. Se toarnă într-o cutie Petri sterilă (A.4.2.2.) încălzită în prealabil la 55oC, mediul însămînţat (5.6.2.), astfel ca să se obţină un strat de 0,6-0,8 mm grosime. Pentru o cutie Petri cu diametrul de 140 mm, trebuie aproximativ 15 ml mediu pentru obţinerea unei grosimi de 0,8 mm.
5.6.4. Se aşază cutiile Petri pe o suprafaţă orizontală rece. Orizontalitatea se verifică cu o bulă de nivel, se înlătură capacele şi se lasă mediul gelozat să se solidifice. După solidificarea mediului, se reaşază capacele pe cutii, se răstoarnă pentru evitarea unei condensări a apei pe suprafaţa mediului gelozat.
5.6.5. Cutiile Petri astfel preparate trebuie folosite de preferinţă în-aceeaşi zi, dar pot fi folosite timp de maxim 2 săptămîni cu condiţia păstrării lor la 5oC într-o pungă de polietilenă închisă ermetic imediat.
5.6.6. Pentru identificarea eşantioanelor se marchează fundul cutiilor Petri.
6. Mod de lucru
6. 1. Prepararea eşantioanelor.
6.1.1. Eşantioanele care dau rezultate pozitive sau dubioase prin metoda A (vezi A. 7.1. şi A. 7.2.) trebuie supuse unei noi analize pentru identificarea şi cuantificarea penicilinei.
6.1.2. În prealabil se încălzesc eşantioanele de lapte Ia 80o\xf11oC timp de 10 minute, pentru a se evita influenţa substanţelor inhibitoare termolabile nespecifice.
6.1.3. Se amestecă cu grijă, apoi se transferă 10 ml din eşantionul încălzit într-un flacon steril cu gîtul lung. Se adaugă 0,4 ml din soluţie de penicilinază (5.3.) la lapte şi se amestecă bine.
6.2. Detectarea substanţelor inhibitoare.
6.2.1. Se plonjează un disc de hîrtie (4.3.) în eşantionul de lapte (6.1.2.) cu ajutorul unei pensete curate şi uscate. Se elimină surplusul de lapte scurgînd (atingînd) discul de hîrtie de gura flaconului. Se plasează discul pe suprafaţa mediului din cutia Petri (5.6.) şi se presează uşor cu ajutorul pensetei.
6.2.2. Discurile impregnate cu diferite eşantioane de lapte trebuie să se aşeze la distanţa de cel puţin 20 mm unele de altele şi 10 mm de marginea cutiei.
6.2.3. Pentru verificarea sensibilităţii metodei, se supun nişte discuri (4.3.) îmbibate cu o soluţie-etalon de penicilină (5.2.) aşezate la întîmplare între discurile impregnate cu eşantionul de lapte în proporţie de minim 2% din numărul de discuri impregnate cu eşantionul de lapte; cinci discuri etalon trebuie să fie utilizate la fiecare test.
6.2.4. După identificarea şi aşezarea tuturor discurilor pe suprafaţa mediului gelozaţ, cutiile se răstoarnă şi se incubează la 63o\xf11oC timp de 2,5 pînă la 5 ore.
6.2.5. După incubare, se examinează cutiile Petri contra unei surse luminoase adecvate pentru a observa zonele clare de inhibare în jurul discurilor de hîrtie. Se măsoară zonele clare.
6.2.6. Soluţia etalon de penicilină (6.2.3.) trebuie să prezinte zone de cel puţin 2 mm în jurul discurilor.
6.2.7. Prezenţa zonelor clare în jurul discurilor imbibate cu eşantionul de lapte cu o dimensiune echivalentă sau superioară celei descrise la 6.2.6. indică prezenţa substanţelor inhibitoare pentru microorganismul test.
6.3. Identificarea şi cuantificarea substanţelor inhibitoare.
6.3.1. Operaţiunea descrisă la 6.2.1. se efectuează în dublu pe eşantionul de lapte încălzit (6.1.2.) şi pe eşantionul tratat cu penicilinază (6.1.3.). În locul adăugării penicilinazei la 10 ml eşantion, este posibilă plonjarea unui disc îmbibat cu penicilinază (5.3.2) în eşantionul de lapte şi plasarea lui în cutia de testare.
6.3.2. Se efectuează operaţiunea 6.2.1. în dublu pentru fie-care din soluţiile etalon de penicilină descrise Ia 5.2. (a - d).
6.3.3. Se calculează media diametrelor zonelor clare de inhibiţie care corespunde eşantionului de lapte, la care s-a adăugat penicilinază şi soluţiile etalon de penicilină.
7. Interpretarea rezultatelor (vezi pct. 2)
7.1. Dacă nu apare nici o zonă clară în jurul discului impregnat cu lapte la care s-a adăugat penicilinaza, dar apare o zonă clară în jurul discului imbibat cu lapte, zonă egală sau superioară zonei din jurul discului impregnat cu soluţia de penicilină etalon (5.2.a.), substanţa inhibitoare prezenţa în eşantionul de lapte corespunde unei concentraţii de benzilpenicilină de sodiu (de potasiu) egală sau superioară cantităţii de 0,004 mg/ml.
7.2. Dacă diametrul mediu al zonei clare din jurul discului impregnat cu lapte, la care s-a adăugat penicilinază este egal cu diametrul mediu al zonei din jurul discului care conţine eşantionul de lapte, laptele conţine substanţe inhibitoare imposibil de inactivat prin concentraţia de penicilinază folosită în prezenta metodă.
7.3. Dacă diametrul mediu al zonei clare din jurul discului impregnat cu laptele la care s-a adăugat penicilinaza este mai mic decît diametrul mediu din jurul discului ce conţine eşantionul de lapte încălzit conform 6.1.2., atunci eşantionul de lapte conţine şi sulfamide, sau penicilină şi penicilină semisintetică, care nu pot fi identificate prin concentraţia de penicilinază folosită în prezenta metodă. Penicilinele sintetice, cum este cloxacilina sodică, pot să nu fie inactivate de penicilinază în condiţiile descrise, şi pot fi atunci clasate ca substanţe inhibitoare, altele decît penicilina.
Notă:
Substanţele inhibitoare, altele decît penicilina, pot fi identificate prin procedee adecvate.
8. Determinarea concentraţiei de penicilină
8.1. Determinarea concentraţiei de penicilină se poate efectua fie prin stabilirea unei curbe de etalonare, fie prin calcule bazate pe dimensiunile zonelor obţinute cu soluţiile de penicilină-etalon în lapte (5.2.a - d).
8.2. Trasarea curbei de etalonare.
Dat fiind faptul că există o corelare liniară între log 10 a concentraţiei de penicilină şi diametrul zonelor de inhibare, curba de etalonare poate fi trasată pe hîrtie semilogaritmică punînd concentraţiile de penicilină pe ordonată şi diametrul zonelor de inhibare - pe abscisă. Calculul diametrului zonelor de inhibare se obţine din media probelor efectuate de două ori. Diametrele zonelor de inhibare sînt puse pe un grafic în funcţie de concentraţiile soluţiilor-etalon de penicilină şi se trasează curba de etalonare.
8.3.Calcul.
Concentraţiile de penicilină dintr-un eşantion de lapte se pot calcula după diametrul zonelor cu ajutorul ecuaţiei de regresie sau a curbei de etalonare. Pentru un dozaj precis, raza zonelor de inhibare trebuie să fie cel puţin de două ori şi cel mult de cinci ori, egală celei a discurilor.
9. Exprimarea rezultatelor
9.1. Rezultatele se exprimă în concentraţii de penicilină egală sau mai mare de 0,004 mg/ml (sau indicînd concentraţia determinată) şi pentru substanţele inhibitoare, altele decît penicilina, în concentraţia echivalentă în penicilină.
9.2. Repetabilitate (r) şi reproductibilitatea(R).
Cifrele nu sînt nici disponibile nici semnificative, din cauza folosirii unui etalon pentru comparaţie.