HGM265/2009
ID intern unic:  331278
Версия на русском
Versiunea originala
Fişa actului juridic

Republica Moldova
GUVERNUL
HOTĂRÎRE Nr. 265
din  06.04.2009
pentru aprobarea Regulamentului privind aplicarea metodelor de
încercări şi interpretarea rezultatelor în domeniul sanitar-veterinar
Publicat : 17.04.2009 în Monitorul Oficial Nr. 75-77     art Nr : 321
    MODIFICAT
    HG1143 din 21.11.18, MO13-21/18.01.19 art.7; în vigoare 18.01.19
    HG51 din 16.01.13, MO15-17/22.01.13 art.89




    În conformitate cu prevederile Legii nr. 221-XVI din 19 octombrie 2007 privind activitatea sanitar-veterinară (Monitorul Oficial al Republicii Moldova, 2008, nr.51-54, art. 153), Legii nr. 1513-XII din 16 iunie 1993 privind asigurarea sanitaro-epidemiologică a populaţiei (republicat în Monitorul Oficial al Republicii Moldova, 2003, nr. 60-61, art. 259), Legii nr. 78-XV din 18 martie 2004 privind produsele alimentare (Monitorul Oficial al Republicii Moldova, 2004, nr. 83–87, art. 431), în scopul excluderii riscului pentru sănătatea publică pe care-l reprezintă unele substanţe, medicamente de uz veterinar şi reziduurile acestora din animalele vii şi produsele de origine animală, precum şi asigurării consumatorilor cu produse alimentare salubre şi inofensive prin aplicarea metodelor performante de detecţie a nivelurilor de substanţe nocive şi interpretarea corectă a rezultatelor obţinute,Guvernul HOTĂRĂŞTE:
    1. Se aprobă Regulamentul privind aplicarea metodelor de încercări şi interpretarea rezultatelor în domeniul sanitar-veterinar (se anexează).
    2. Controlul asupra executării prezentei hotărîri se pune în sarcina Agenției Naționale pentru Siguranța Alimentelor.
    [Pct.2 modificat prin HG1143 din 21.11.18, MO13-21/18.01.19 art.7; în vigoare 18.01.19]

    PRIM-MINISTRU                                                     Zinaida GRECEANÎI

    Contrasemnează:
    Ministrul agriculturii
    şi industriei alimentare                                               Anatolie Gorodenco
 
    Nr. 265. Chişinău, 6 aprilie 2009.

Aprobat
prin Hotărîrea Guvernului
nr.265 din 6 aprilie 2009
Regulament
privind aplicarea metodelor de încercări şi interpretarea
rezultatelor
în domeniul sanitar-veterinar
    1. Regulamentul privind aplicarea metodelor de încercări şi interpretarea rezultatelor în domeniul sanitar-veterinar (în continuare – Regulament) stabileşte cerinţe la aplicarea metodelor de încercări folosite la examinarea probelor oficiale prelevate de medicii veterinari oficiali şi/sau împuterniciţi în scopul supravegherii şi controlului unor substanţe, reziduurilor acestora şi reziduurilor de medicamente de uz veterinar la animalele vii şi în produsele de origine animală, precum şi criterii comune pentru interpretarea rezultatelor de către laboratoarele care răspund de controlul oficial al acestor probe.
    2. Prezentul Regulament nu se aplică substanţelor pentru care au fost stabilite norme specifice prevăzute de legislaţia naţională.
    3. Prevederile prezentului Regulament transpune prevederile Deciziei Comisiei Comunităţilor Europene nr. 2002/657 din 14 august 2002 de stabilire a normelor de aplicare a Directivei 96/23/CE a Consiliului privind funcţionarea metodelor de analiză şi interpretarea rezultatelor (Jurnalul Oficial al Uniunii Europene, L 221, 17.08.2002, pag. 8).
    4. În sensul prezentului Regulament se utilizează noţiunile referitoare la măsurile de supraveghere şi control al unor substanţe şi al reziduurilor acestora la animale vii şi la produsele lor şi al reziduurilor de medicamente de uz veterinar în produsele de origine animală, precum şi cele specificate în anexă la prezentul Regulament.
    5. certificatul de inofensivitate, eliberat de Agenţia Naţională pentru Siguranţa Alimentelor (în continuare – Agenţie) trebuie să ia toate măsurile pentru ca probele oficiale prelevate de medicii veterinari oficiali şi/sau împuterniciţi să fie analizate cu ajutorul unor metode, care:
    [Pct.5 modificat prin HG51 din 16.01.13, MO15-17/22.01.13 art.89] 
    a) sînt documentate în instrucţiunile de teste în conformitate cu standardul ISO 5725 - 4;
    b) sînt în conformitate cu compartimentul 2 din anexa la prezentul Regulament;
    c) au fost validate în conformitate cu procedurile descrise în compartimentul 3 din anexa la prezentul Regulament.
    6. Metodele de analiză trebuie să corespundă limitelor de funcţionare minime cerute (MRPL).
    În cazul substanţelor pentru care nu a fost stabilită nici o limită autorizată, Agenţia va propune, în baza progresului tehnico-ştiinţific şi stabilrea unor norme pe plan internaţional, completări în vederea stabilirii progresive a limitelor de funcţionare minime cerute (MRPL) şi care se vor aplica metodelor de încercări utilizate.
    7. Agenţia trebuie să asigure calitatea rezultatelor încercărilor probelor, în special prin teste de control şi/sau rezultate de etalonare în conformitate cu standardul SM SR EN ISO/CEI 17025:2006.
    8. Rezultatul unei încercări este considerat neconform în cazul în care este depăşită limita de decizie a metodei de confirmare pentru analitul examinat.
    9. În cazul în care a fost stabilită limita autorizată pentru o substanţă, limita de decizie este concentraţia de la care este posibil să se decidă cu o certitudine statistică de 1 – α că a fost într-adevăr depăşită limita autorizată.
    10. În cazul în care nu a fost stabilită nici o limită autorizată pentru o substanţă, limita de decizie este cel mai scăzut nivel de concentraţie la care o metodă poate demonstra cu certitudine statistică de 1 – α dacă analitul examinat este prezent.
    11. Pentru substanţele cu efect anabolic şi neautorizate, stilbene, derivatele stilbenelor, sărurile şi esterii acestora, antitiroide, steriozi, lactone ale acidului rezorcinic, inclusiv zeranol, beta-agonişti, substanţe farmacologice active pentru care nu poate fi prevăzută o limită maximă pentru produsele de origine animală (în continuare –substanţe din grupa A), eroarea α este egală cu sau mai mică decît 1 %.
    Pentru toate celelalte substanţe, eroarea α este egală cu sau mai mică decît 5 %.
    12. Centrului Republican de Diagnostic Veterinar însărcinat să efectueze aceste încercări i se acordă un termen de cel mult 3 ani pentru conformarea cu prevederile prezentului Regulament.
    13. În cazul în care este iraţională sau imposibilă implementarea unor metode de încercări în conformitate cu prevederile prezentului Regulament, laboratoarele obligate să efectueze aceste încercări trebuie să încheie, prin intermediul autorităţii naţionale competente, contracte privind efectuarea încercărilor pentru confirmarea rezultatelor cu unul din laboratoarele de referinţă din alte state.

Anexă
la Regulamentul privind aplicarea
metodelor de încercări şi interpretarea
rezultatelor în domeniul sanitar-veterinar
Criterii de funcţionare, alte cerinţe şi proceduri
care se aplică metodelor de încercări
    1. Definiţii
    În sensul prezentului Regulament noţiunile utilizate au următoarele semnificaţii:
    exactitate de măsurare – grad de concordanţă între rezultatul unei măsurări şi valoarea convenţional adevărată a mărimii măsurate;
    eroare alfa (α) – probabilitatea ca proba testată să fie conformă chiar în cazul în care s-a obţinut o măsurătoare neconformă (“decizie întemeiată pe un fals rezultat neconform”);
    analit – substanţa care trebuie detectată, identificată şi/sau cuantificată şi derivatele care apar în cursul analizei;
    eroare beta (β) – probabilitatea ca proba testată să fie într-adevăr neconformă, chiar în cazul în care s-a obţinut o măsurătoare conformă (“decizie întemeiată pe un fals rezultat conform”);
    eroare sistematică – diferenţa dintre media aritmetică a rezultatelor unui număr infinit de măsurări ale aceluiaşi măsurand, efectuate în condiţii de repetabilitate, şi o valoare adevărată a măsurandului;
    etalon – mijloc de măsurare destinat să definească, să realizeze, să conserve sau să reproducă o unitate ori una sau mai multe valori ale unei mărimi pentru a servi ca referinţă;
    material de referinţă certificat (MRC) – material de referinţă însoţit de un certificat ale cărui valori (una sau mai multe) ale proprietăţii (proprietăţilor) sale este (sînt) certificate printr-o procedură care stabileşte trasabilitatea la o realizare exactă a unităţii (unităţilor) în care sînt exprimate valorile proprietăţii (proprietăţilor) şi pentru care fiecare valoare certificată este însoţită de o incertitudine la un nivel de încredere indicat;
    material de referinţă – mijloc de măsurare, material sau substanţă ale cărei valori (una sau mai multe) ale proprietăţii (proprietăţilor) sînt suficient de omogene şi bine stabilite pentru a fi utilizate la verificarea şi/sau etalonarea unui mijloc de măsurare, la evaluarea unei proceduri de măsurare legale sau la atribuirea de valori materialelor ori substanţelor;
    cocromatografie – metodă în care se împarte în două fracţii extractul supus testării înainte de etapa sau etapele cromatografice. O fracţie este analizată cromatografic ca atare. A doua fracţie este amestecată cu analitul etalon care urmează să fie măsurat. Acest amestec este apoi analizat cromatografic. Cantitatea de analit etalon adăugată trebuie să fie apropiată de cantitatea de analit estimată în extract. Această metodă este destinată să amelioreze identificarea unui analit prin metode cromatografice, în special în cazul în care este imposibil să se utilizeze un etalon intern corespunzător;
    studiu în colaborare – analiza aceleiaşi probe cu aceeaşi metodă, în scopul determinării caracteristicilor de aplicare a metodei. Studiul acoperă eroarea aleatorie de măsurare şi eroarea sistematică de laborator;
    metodă de confirmare – metode care furnizează informaţii complete sau complementare care permit identificarea univocă a substanţei şi, după caz, cuantificarea acesteia la nivelul considerat;
    limita de decizie (CCα) – limita la care şi de la care este permis să se concluzioneze cu probabilitatea de eroare α că o probă nu este conformă;
    capacitatea de detecţie (CCβ) – cel mai mic conţinut de substanţă care poate fi detectat, identificat şi/sau cuantificat într-o probă, cu probabilitatea de eroare β. În cazul substanţelor pentru care nu a fost stabilită nici o limită autorizată, capacitatea de detecţie este concentraţia minimă la care o metodă poate detecta probe într-adevăr contaminate, cu certitudinea statistică de 1 – β. În cazul substanţelor pentru care s-a stabilit o limită autorizată, capacitatea de detecţie este concentraţia la care metoda poate detecta concentraţii la limita autorizată cu o certitudine statistică de 1 – β;
    material de probă îmbogăţit – probă la care se adaugă o cantitate cunoscută din analitul care urmează să fie detectat;
    studiu (comparaţie) interlaboratoare – organizarea, realizarea şi evaluarea metodelor pe aceeaşi probă de către două sau mai multe laboratoare, în condiţii prestabilite, cu scopul de a determina modul de aplicare a metodei. În funcţie de obiectiv, studiul este considerat studiu în colaborare sau test de aptitudini;
    etalon intern – substanţă neconţinută în probă, avînd proprietăţi fizico-chimice cît mai apropiate posibil de cele ale analitului de identificat, care se adaugă fiecărei probe şi fiecărui etalon;
    probă oficială – cantitatea de material biologic sau produs de origine animală prelevată dintr-un lot de către un medic veterinar oficial sau împuternicit în cadrul unui program de control şi supraveghere sanitar-veterinară, rezultatele cercetării căreia stau la baza luării deciziei de către persoana care a prelevat proba în cauză;
    probă de laborator – probă preparată în vederea expedierii către laborator şi destinată examinării sau încercării;
    nivel considerat – concentraţia substanţei sau a analitului într-o probă care este semnificativă pentru determinarea conformităţii acestuia cu legislaţia;
    limita de funcţionare minimă cerută (MRPL) – conţinutul minim de analit într-o probă care trebuie cel puţin detectat şi confirmat. Este destinată armonizării capacităţilor analitice ale metodelor care se aplică substanţelor în cazul cărora nu a fost stabilită nici o limită autorizată;
    caracteristica de funcţionare – calitate funcţională care poate fi atribuită unei metode de analiză. Aceasta poate fi, de exemplu, specificitatea, exactitatea, precizia, fidelitatea, repetabilitatea, reproductibilitatea, recuperarea, capacitatea de detecţie şi robusteţea;
    criteriu de funcţionare – cerinţe în materie de caracteristici de funcţionare, faţă de care este posibil să se aprecieze că o metodă de analiză este adecvată scopului urmărit şi dă rezultate fiabile;
    limită autorizată – limita maximă a reziduurilor, conţinut maxim sau altă toleranţă maximă aplicabilă substanţelor şi stabilită în alte acte normative naţionale;
    fidelitate – gradul de apropiere dintre rezultatele unor teste independente obţinute în condiţii stabilite (predeterminate). Măsura fidelităţii este de obicei exprimată în termeni de nonfidelitate şi este calculată plecînd de la deviaţia standard a rezultatelor. Cu cît deviaţia standard este mai mare, cu atît fidelitatea este mai mică;
    test de aptitudini – analiza aceleiaşi probe, ceea ce permite laboratoarelor să îşi aleagă propriile metode, cu condiţia ca acestea să fie utilizate în condiţii de rutină. Testul trebuie realizat în conformitate cu ghidurile internaţionale (ISO 43-1 şi 43-2) şi poate fi utilizat la evaluarea reproductibilităţii metodelor;
    metodă calitativă – metodă de analiză care identifică o substanţă pe baza proprietăţilor chimice, biologice sau fizice;
    metodă cantitativă – metodă de analiză care determină cantitatea sau fracţia masică a unei substanţe astfel încît să poată fi exprimată ca valoare numerică, în unităţi corespunzătoare;
    test blanc de reactiv – procedeul complet de încercări aplicat în absenţa fracţiei de analizat sau folosind o cantitate echivalentă de solvent corespunzător în locul fracţiei de analizat;
    recuperare – procentul din concentraţia reală a unei substanţe recuperate pe parcursul procedeului analitic. Aceasta se determină pe parcursul validării, în absenţa unui material de referinţă certificat;
    repetabilitate – fidelitate în condiţii de repetabilitate;
    condiţii de repetabilitate – condiţii în care rezultatele unor încercări independente sînt obţinute prin aceeaşi metodă, pe preparate de încercare identice, în acelaşi laborator, de către acelaşi utilizator, folosind acelaşi echipament;
    reproductibilitate – fidelitate în condiţii de reproductibilitate;
    condiţii de reproductibilitate – condiţii în care rezultatele încercărilor sînt obţinute prin aceeaşi metodă, pe preparate de încercare identice în laboratoare diferite, de către utilizatori diferiţi şi folosind echipamente diferite;
    robusteţe – sensibilitatea unei metode de încercări la variaţii ale condiţiilor experimentale, care se pot exprima ca listă de probe, de analiţi, de condiţii de depozitare, de condiţii de mediu şi/sau de preparare a probei pentru care metoda poate fi aplicată ca atare sau cu anumite modificări minore. Pentru toate condiţiile experimentale care, în practică, sînt supuse unor variaţii (de exemplu, stabilitatea reactivilor, compoziţia probei, pH, temperatura) se indică toate variaţiile care pot influenţa rezultatul analizei;
    test blanc de probă – procedeul complet de încercări aplicat unei fracţii de analizat prelevată dintr-o probă care nu conţine analitul;
    metodă de depistare – metodă care serveşte la detectarea prezenţei unei substanţe sau unei clase de substanţe la nivelul considerat. Aceste metode prezintă o mare capacitate de tratare a probelor şi sînt aplicate pentru a tria un număr mare de probe în vederea detectării potenţialelor rezultate neconforme. Ele sînt concepute, în special, pentru a evita falsele rezultate conforme;
    studiu monolaborator (validare internă) – studiu analitic cu implicarea unui singur laborator, care utilizează o singură metodă la analiza unor materiale de testare identice sau diferite, în condiţii diferite, în intervale de timp justificat de lungi;
    specificitate – capacitatea unei metode de a demonstra între analitul măsurat şi alte substanţe. Această caracteristică este în principal o funcţie a tehnicii de măsurare descrise, dar poate varia în funcţie de clasa compusului sau de matrice;
    adaos etalonat – metodă prin care proba de testare este împărţită în două fracţii de analizat (sau mai multe). O fracţie este analizată ca atare, iar celorlalte fracţii li se adaugă, înainte de a fi analizate, cantităţi cunoscute de analit etalon. Cantitatea de analit etalon adăugată trebuie să constituie de la două la cinci ori cantitatea de analit estimată în probă. Această metodă permite determinarea conţinutului unui analit în probă, ţinînd seama de recuperarea proprie procedeului de încercări respectiv;
    analit etalon – analit de conţinut şi puritate cunoscut şi certificat, care serveşte drept referinţă pe parcursul analizei;
    substanţă – materie cu o structură chimică specială sau definită şi metaboliţii acesteia;
    fracţia de analizat – cantitatea de material prelevată din proba de testare, care face efectiv obiectul analizei sau al examinării;
    probă de testare – probă preparată pornind de la proba de laborator şi din care trebuie prelevate fracţiile de analizat;
    precizie – gradul de apropiere între valoarea medie obţinută plecînd de la o serie vastă de rezultate ale testelor şi o valoare de referinţă acceptată. Precizia este în general exprimată în termeni de eroare sistematică;
    unitate de măsură – mărime particulară, definită şi adoptată prin convenţie, cu care sînt comparate alte mărimi de aceeaşi natură, ca rezultat al măsurării, pentru exprimarea valorilor lor în raport cu acea mărime;
    validare – confirmarea prin examen şi furnizarea de probe concrete privind îndeplinirea cerinţelor specifice pentru o utilizare specifică;
    reproductibilitate intralaborator – fidelitate obţinută în acelaşi laborator în condiţii stabilite (predeterminate) (privind, de exemplu, metoda, materialele de testare, utilizatorii, condiţiile ambiante), pentru intervale de timp justificat de lungi;
    mijloc de măsurare – măsură, aparat de măsurat, traductor, dispozitiv, echipament, sistem de măsurare, instalaţie, precum şi material de referinţă, utilizate în mod independent sau asociate cu unul ori mai multe dispozitive suplimentare, care furnizează informaţii de măsurare.
2. Criteriile şi cerinţele la aplicarera metodelor de încercări
    Metodele sau combinaţiile de metode de încercări, altele decît cele descrise în continuare, nu pot fi utilizate pentru depistare sau confirmare decît în cazul în care se poate stabili că îndeplinesc cerinţele relevante specificate în prezentul Regulament.
    Mijloacele şi echipamentele de măsurare utilizate în metodele sau combinaţiile de metode de încercări necesită să fie adecvate, legalizate şi verificate metrologic, conform cerinţelor prescrise în Sistemul Naţional de Metrologie.
    2.1. Cerinţe generale
    2.1.1. Manipularea probelor oficiale
    Probele trebuie obţinute, manipulate şi tratate astfel încît posibilităţile de detectare a substanţei să fie maxime. Metodele de manipulare a probelor trebuie să împiedice contaminarea sau pierderea accidentală de analiţi.
    2.1.2. Realizarea testelor
    2.1.2.1. Recuperare
    Pe parcursul analizei probelor este necesar ca recuperarea să fie determinată pentru fiecare lot de probe, în cazul în care se utilizează un factor de corecţie de recuperare fix. În cazul în care recuperarea este în limite, poate fi utilizat factorul de corecţie stabilit. În caz contrar, trebuie să fie utilizat factorul de recuperare obţinut pentru lotul respectiv, cu excepţia cazului în care se aplică factorul de recuperare specific al analitului în probă, caz în care este necesar să se utilizeze metoda adaosurilor etalonate (punctul 3.5.) sau un etalon intern pentru determinarea cantitativă a unui analit într-o probă.
    2.1.2.2. Specificitate
    O metodă trebuie să aibă capacitatea de a diferenţia analitul de alte substanţe în condiţiile experimentale. Trebuie prezentată o estimare a acestei capacităţi. Este necesar să se aplice strategii pentru a evita orice interferenţă previzibilă cu alte substanţe în cazul în care se utilizează tehnica de măsurare (de exemplu, omologi, analogi, metaboliţi ai reziduului în cauză). Este foarte important să fie analizată orice interferenţă care ar putea fi provocată de elementele componente ale matricei.
2.2. Metode de depistare
    În scopul depistării se aplică numai acele metode de încercări pentru care se poate demonstra, pe baza unor probe identificabile, că sînt validate şi au un procent de false rezultate conforme mai mic de 5 % (eroare β) la nivelul considerat. În cazul unui rezultat neconform suspect, acesta trebuie confirmat printr-o metodă de confirmare.
2.3. Metodele de confirmare
 a reziduurilor organice şi contaminanţilor

    Metodele de confirmare pentru reziduurile organice şi contaminanţi furnizează indicaţii privind structura chimică a analitului. În consecinţă, metodele bazate exclusiv pe analiza cromatografică fără utilizarea detecţiei spectrometrice nu sînt suficiente ca metode de confirmare. În cazul în care o metodă concretă nu prezintă specificitate suficientă, specificitatea cerută trebuie obţinută cu ajutorul procedeelor de încercări constînd în combinaţii corespunzătoare de purificare, separare (separări) cromatografică(e) şi detecţie spectrometrică.
    Metodele sau combinaţiile de metode menţionate în continuare sînt considerate corespunzătoare pentru identificarea reziduurilor organice sau a contaminanţilor pentru grupele de substanţe menţionate.

Tabelul nr. 1

Metodele de confirmare corespunzătoare pentru

reziduurile organice şi contaminanţi

Tehnica de măsurare
Substanţa
Restricţii

Cromatografie în fază lichidă (LC) sau cromatografie în fază gazoasă (GC) cu spectrometrie de masă

Grupele A şi B

Numai în urma unei separări cromatografice în flux sau autonome

Numai în cazul în care se utilizează tehnici cu baleiaj complet sau folosind cel puţin 3 (grupa B) sau 4 (grupa A) puncte de identificare pentru metodele care nu înregistrează spectre de masă complete

LC sau GC cu detecţie spectrometrică IR

Grupele A şi B

Trebuie îndeplinite cerinţele specifice pentru absorbţia în spectrometrie infraroşu (IR)

Cromatografie în fază lichidă cu baleiaj complet (DAD – detecţie cu reţea de diode)

Grupa B

Trebuie îndeplinite cerinţele specifice pentru absorbţia în spectrometrie ultravioletă (UV)

Fluorescenţă LC
Grupa B

Numai pentru moleculele avînd fluorescenţă naturală şi moleculele care prezintă fluorescenţă după transformare sau derivatizare

Cromatografie în strat subţire 2-D cu baleiaj complet UV/VIS

Grupa B

Sînt obligatorii cromatografia în strat subţire de înaltă performanţă (HPTLC) bidimensională (2D) şi cocromatografia

Cromatografie în stare gazoasă – detecţie cu captură de electroni

Grupa B

Numai în cazul în care se utilizează două coloane cu polarităţi diferite

Imunogramă LC
Grupa B

Numai în cazul în care se utilizează cel puţin două sisteme cromatografice diferite sau o a doua metodă de detecţie, independentă

LC-UV/VIS (unică lungime de undă)
Grupa B

Numai în cazul în care se utilizează cel puţin două sisteme cromatografice diferite sau o a doua metodă de detecţie, independentă

 
    2.3.1. Criteriile de aplicare şi cerinţele comune
    Metodele de confirmare furnizează indicaţii asupra structurii chimice a analitului. În cazul în care mai multe elemente componente dau acelaşi răspuns, metoda nu permite stabilirea unei distincţii între acestea.         Metodele bazate numai pe analiza cromatografică, fără să prevadă utilizarea detecţiei spectrometrice, nu sînt suficiente ca metode de confirmare.
    În cazul în care este folosit în metodă un etalon intern adecvat fracţiei de analizat, se adaugă la începutul extracţiei. În funcţie de disponibilităţi, se pot folosi fie forme de analit marcate cu un izotop stabil, recomandate în special pentru detecţia prin spectroscopie de masă, fie compuşi structurali înrudiţi cu analitul.
    În cazul în care nu este posibil să se folosească un etalon intern corespunzător, identificarea analitului se confirmă prin cocromatografie. În acest caz se obţine un singur pic, creşterea înălţimii sau a suprafeţei intensificate a picului echivalînd cu cantitatea de analit adăugată. La cromatografia în fază gazoasă (GC) sau în fază lichidă (LC), lărgimea picului la jumătate din înălţimea maximă trebuie să se situeze între 90 % şi 110 % din lărgimea iniţială, iar timpii de retenţie trebuie să fie identici, cu o marjă de 5 %. În ceea ce priveşte metodele de cromatografie în strat subţire (TLC), se intensifică numai spotul prezumat a fi al analitului; nu apar spoturi suplimentare şi aspectul acestuia nu se modifică.
    Materialul de referinţă sau îmbogăţit, conţinînd cantităţi cunoscute de analit la nivelul sau la un nivel apropiat de limita autorizată ori de limita de decizie (probă de control neconformă), ca şi materialele de control conforme şi blancurile de reactivi, se analizează de preferinţă odată cu fiecare lot de probe analizat, aplicînd procedeul complet. Injectarea extractelor în instrumentul de încercări se efectuează în ordinea următoare: blanc de reactiv, probă de control conformă, probă (probe) de confirmat, o nouă probă de control conformă şi, în final, probă de control neconformă. Orice altă ordine trebuie justificată.
    2.3.2. Criteriile de funcţionare şi cerinţele suplimentare aplicabile metodelor de încercări cantitative
    2.3.2.1. Precizia metodelor cantitative
    În cazul analizelor repetate pe un material de referinţă certificat, deviaţia fracţiei masice medii, corectate cu recuperarea determinată experimental, de la valoarea certificată se situează între următoarele limite:

Tabelul nr. 2

Precizia minimă a metodelor cantitative

Fracţie masică
Plajă de valori
≤ 1 μg/kg
> 1 μg/kg pînă la 10 μg/kg
≥ 10 μg/kg
–50 % pînă la + 20 %
–30 % pînă la + 10 %
–20 % pînă la + 10 %
    În cazul în care nici un material de referinţă certificat de acest tip nu este disponibil, se poate admite ca precizia măsurărilor să fie evaluată prin recuperarea adaosurilor în cantităţi cunoscute de analit sau de analiţi la un blanc de matrice. Datele corectate cu recuperarea medie nu sînt admisibile decît în cazul în care se situează în intervalele menţionate în tabelul nr. 2.
    2.3.2.2. Fidelitatea metodelor cantitative
    Coeficientul de variaţie (CV) interlaboratoare pentru analiza repetată a unui material de referinţă sau îmbogăţit în condiţii de reproductibilitate nu trebuie să depăşească nivelul calculat în continuare cu ecuaţia lui Horwitz:
    CV = 2(1-0,5logC):
    în care C reprezintă fracţia masică exprimată ca putere (exponent) a lui 10 (de exemplu, 1 mg/g = 10-3).
    În tabelul nr. 3 sînt prezentate exemple.
Tabelul nr. 3

Exemple de reproductibilitate a CV pentru metodele cantitative

într-o plajă de fracţii masice ale analitului

Fracţie masică
Reproductibilitatea CV (%)
1 μg/kg
10 μg/kg
100 μg/kg
1000 μg/kg (1 mg/kg)
(*)
(*)
23
16

(*) Pentru fracţiile masice mai mici de 100 μg/kg aplicarea ecuaţiei lui Horwitz dă valori ridicate inadmisibile. În consecinţă, CV pentru concentraţiile mai mici de 100 μg/kg trebuie să fie cît mai coborîte posibil.


    Pentru încercările efectuate în condiţii de repetabilitate, CV intralaborator se situează în general între jumătate şi două treimi din valorile menţionate anterior. Pentru încercările efectuate în condiţii de reproductibilitate intralaborator, CV intralaborator nu trebuie să depăşească CV de reproductibilitate.
    În cazul substanţelor pentru care este stabilită o limită autorizată, este necesar ca metoda să atingă o reproductibilitate intralaborator nu mai mare decît valoarea CV de reproductibilitate corespunzătoare unei concentraţii de 0,5 × limita autorizată.
    2.3.3. Criteriile de funcţionare şi alte cerinţe aplicabile la detecţia prin spectrometrie de masă
    Metodele de spectrometrie de masă pot fi considerate drept metode de confirmare numai după o separaţie cromatografică în linie sau autonomă.
    2.3.3.1. Separaţia cromatografică
    Pentru procedeele GC-MS, separaţia cromatografică în fază gazoasă se efectuează cu ajutorul coloanelor capilare. Pentru procedeele LC-MS, separaţia cromatografică se efectuează cu ajutorul unor coloane LC adaptate. În toate cazurile, timpul de retenţie minim admisibil pentru analitul studiat depăşeşte de două ori timpul de retenţie corespunzător volumului coloanei fără umplutură. Timpul de retenţie (sau timpul de retenţie relativ) al analitului în fracţia analizată corespunde timpului de retenţie al etalonului într-o fereastră dată de timp de retenţie. Fereastra de timp de retenţie este proporţională cu puterea de rezoluţie a sistemului cromatografic. Raportul dintre timpul de retenţie cromatografică al analitului şi cel al etalonului intern, adică timpul de retenţie relativ al analitului, trebuie să corespundă celui al soluţiei de etalonare cu o toleranţă de ± 0,5 % pentru GC şi de ± 2,5 % pentru LC.
    2.3.3.2. Detecţia prin spectrometrie de masă
    Detecţia prin spectrometrie de masă se efectuează cu ajutorul tehnicilor MS, cum sînt înregistrarea spectrelor de masă complete (baleiaj complet sau full scan) sau monitorizarea ionilor selecţionaţi (SIM – Selected Ion Monitoring), precum şi al tehnicilor MS-MSn, cum sînt monitorizarea reacţiilor selecţionate (Selected Reaction Monitoring, SRM) sau alte tehnici MS sau MS-MSn adaptate, asociate cu modurile de ionizare corespunzătoare. În spectrometria de masă de înaltă rezoluţie (HRMS), rezoluţia caracteristică trebuie să fie mai mare de 10000 pentru toată plaja maselor, cu o vale de 10 %.
    Baleiaj complet (full scan): în cazul în care determinarea prin spectrometrie de masă se efectuează înregistrînd spectre complete, este obligatorie prezenţa tuturor ionilor de diagnostic măsuraţi (ioni moleculari, aducţi caracteristici ionului molecular, ioni fragmentaţi caracteristici şi ioni izotopi), cu o intensitate relativă mai mare de 10 % în spectrul de referinţă al etalonului.
    SIM:  în cazul în care determinarea prin spectrometrie de masă este efectuată prin fragmentografie, ionul molecular este de preferinţă unul din ionii de diagnostic selecţionaţi (ioni moleculari, aducţi caracteristici ionului molecular, ioni fragmentaţi caracteristici şi toţi ionii izotopi ai acestora). Ionii de diagnostic nu trebuie să provină în exclusivitate din aceeaşi parte a moleculei. Raportul semnal-zgomot pentru fiecare ion diagnostic este ≥ 3:1.
    Baleiaj complet şi SIM: intensităţile relative ale ionilor detectaţi, exprimate în procente din intensitatea ionului celui mai intens sau din tranziţia cea mai intensă, trebuie să corespundă intensităţilor etalonului, fie din soluţiile etalon, fie din probe îmbogăţite, la concentraţii comparabile, măsurate în aceleaşi condiţii, în limitele următoarelor toleranţe:

Tabelul nr. 4

Toleranţele maxime admisibile pentru intensităţile ionice relative

în diferite tehnici de spectrometrie de masă

Intensitatea relativă (% din picul de bază)
EI-GC-MS (relativ)
CI-GC-MS, GC-MSn LC-MS, LC-MSn (relative)
> 50 %
> 20 % pînă la 50 %
> 10 % pînă la 20 %
≤ 10 %
±10 %
±15 %
±20 %
±50 %
±20 %
±25 %
±30 %
±50 %

    Interpretarea datelor spectrelor de masă: intensităţile relative ale ionilor de diagnostic şi/sau ale perechilor de ioni precursori/produşi se identifică prin compararea spectrelor sau prin integrarea semnalelor fiecărei urme de masă izolate. În cazul în care se aplică o corecţie de fundal, aceasta este uniformă pe tot lotul (a se vedea punctul 2.3.1., alineatul 4) şi este indicată explicit.
    Baleiaj complet: în cazul în care sînt înregistrate în MS simplă spectre complete, un minim de patru ioni trebuie să fie prezenţi la intensitate relativă ≥ 10 % din picul de bază. Ionul molecular trebuie inclus, în cazul în care este prezent în spectrul de referinţă cu o intensitate relativă ≥ 10 %. Cel puţin patru ioni trebuie să se situeze în toleranţele maxime admisibile pentru intensităţile ionice relative (tabelul nr. 5). Poate fi folosită căutarea bibliografică asistată de computer. În acest caz, comparaţia datelor spectrale ale probelor de testare cu acelea ale soluţiilor de etalonare trebuie să depăşească un factor de corespondenţă critic. Acest factor se determină în timpul procedurii de validare pentru fiecare analit, în baza spectrelor pentru care sînt îndeplinite criteriile de mai jos. Se verifică variabilitatea spectrelor induse de matrice şi aplicarea detectorului.
    SIM: în cazul în care sînt măsurate fragmente de masă cu ajutorul unor tehnici, altele decît baleiajul complet, se foloseşte un sistem de puncte de identificare pentru interpretarea datelor. Pentru confirmarea substanţelor cu efect anabolic şi neautorizate, stilbenelor, derivatelor, sărurilor şi esterilor stilbenelor, antitiroidelor, steriozilor, lactonelor ale acidului rezorcinic, inclusiv zeranol, beta-agoniştilor (în continuare – substanţe din grupa A), sînt necesare minimum 4 puncte. Pentru confirmarea medicamentelor de uz veterinar şi altor contaminanţi pentru produsele de origine animală (substanţe antibacteriane, inclusiv sulfanilamidele şi chinolonele; alte medicamente de uz veterinar, inclusiv antihelmintice, coccidiostatice, inclusiv nitronidazol, carbamaţi şi peritroizi, sedative, antiinflamatorii nesteroidoieni, alte sustanţe farmacologic active; alte substanţe şi contaminanţi ai mediului, compuşii organocloruraţi, compuşii organofosforici, elemente chimice, micotoxine, coloranţi, alte subtanţe, inclusiv alte substanţe de uz veterinar neautorizate în continuare – substanţe din grupa B), sînt necesare minimum 3 puncte de identificare. Tabelul nr.5 indică numărul de puncte de identificare care poate fi obţinut prin fiecare din tehnicile de bază din spectrometria de masă. Cu toate acestea, pentru a îndeplini condiţiile privind punctele de identificare necesare pentru confirmare şi pentru efectuarea sumei punctelor de identificare:
    a) se măsoară cel puţin un raport ionic;
    b) toate rapoartele ionice relevante măsurate trebuie să respecte criteriile descrise anterior;
    c) pot fi combinate maximum trei tehnici distincte pentru a obţine numărul minim de puncte de identificare.
Tabelul nr. 5

Legătura între diferite clase de fragmente de masă

şi punctele de identificare obţinute

Tehnica MS
Puncte de identificare obţinute pe ion

Spectrometrie de masă cu rezoluţie slabă (LR)

Precursor de ioni LR-MSn
Produse de tranziţie LR-MSn
HRMS
Precursor de ioni HR-MSn
Produse de tranziţie HR-MSn
1,0
1,0
1,5
2,0
2,0
2,5

    Note:
    1. Fiecare ion nu poate fi numărat decît o singură dată.
    2. GC-MS cu ionizare prin impact electronic este considerată o tehnică diferită de GC-MS cu ionizare chimică (IC).
    3. Pot fi utilizaţi mai mulţi analiţi pentru a mări numărul punctelor de identificare numai în cazul în care derivaţii prezintă tipuri diferite de reacţii chimice.
    4. Pentru substanţele din grupa A, în cazul în care se foloseşte una din următoarele tehnici în procedeul de încercări: HPLC cuplată cu fotospectrometria cu şir de diode cu baleiaj complet (DAD); HPLC cuplată cu detecţie prin fluorescenţă; HPLC cuplată cu o imunogramă; TLC bidimensională cuplată cu detecţia spectrometrică, aceasta poate contribui cu maximum un singur punct de identificare, cu condiţia să respecte criteriile relevante pentru aceste tehnici.
    5. Produsele de tranziţie cuprind şi produsele din a doua şi a treia generaţie.

Tabelul nr. 6

Exemple de număr de puncte de identificare obţinute

prin diferite tehnici şi combinaţii de tehnici (n = număr întreg)

Tehnică (tehnici)
Număr de ioni
Puncte de identificare

GC-MS (EI sau CI)

GC-MS (EI şi CI)

GC-MS (EI sau CI) 2 derivaţi

LC-MS
GC-MS-MS
LC-MS-MS
GC-MS-MS
 
LC-MS-MS
 
LC-MS-MS-MS
 
HRMS

GC-MS şi LC-MS

GC-MS şi HRMS
N
2 (EI) + 2 (CI)

2 (derivat A) + 2 (derivat B)

N

1 ion precursor şi 2 din generaţia a doua

1 ion precursor şi 2 din generaţia a doua

2 ioni precursori, fiecare cu un ion din generaţia a doua

2 ioni precursori, fiecare cu un ion din generaţia a doua

1 ion precursor, un ion din generaţia a doua şi un ion din generaţia a treia

N
2 + 2
2 + 1
n
4
4
n
4
4
5
 
5
 
5,5
 
2n
4
4
    2.3.4. Criterii de funcţionare şi alte cerinţe care se aplică în cromatografia cuplată cu detecţie în infraroşu
    Picuri adecvate: picurile adecvate sînt maxime de absorbţie în spectrul infraroşu al unui etalon care îndeplineşte condiţiile menţionate în continuare.
    2.3.4.1. Detecţie în infraroşu
    Maximum de absorbţie: trebuie să se situeze în plaja numerelor de undă de la 4000 la 500 cm-1.
    Intensitate de absorbţie: aceasta nu trebuie să fie mai mică de:
    a) o absorbţie molară specifică de 40 în raport cu linia de bază a picului; sau
    b) o absorbţie relativă de 12,5 % din absorbţia celui mai intens pic în zona 4000-500 cm-1.
    În cazul în care cele două sînt măsurate în raport cu absorbţia nulă şi la 5 % din absorbţia picului celui mai intens în zona de 4000-500 cm-1 atunci cele două sînt măsurate în raport cu linia de bază a picului acestora.
    Notă: Trebuie observat că, deşi în teorie pot fi preferate picuri măsurate în conformitate cu litera a), picurile prevăzute la litera b) sînt mai uşor de determinat în practică.
    Se determină numărul de picuri în spectrul infraroşu al analitului ale cărui frecvenţe corespund unui pic adecvat în spectrul etalon, cu o marjă de ± 1 cm-1.


    2.3.4.2. Interpretarea datelor spectrului infraroşu
    Absorbţia trebuie să fie prezentă în toate zonele spectrului analitului care corespund unui pic adecvat din spectrul de referinţă al etalonului. Se cer minimum 6 picuri adecvate în spectrul infraroşu al etalonului. În cazul în care există mai puţin de 6 picuri adecvate, spectrul infraroşu în cauză nu se utilizează ca spectru de referinţă. “Rezultatul”, adică procentul de picuri adecvate constatat în spectrul infraroşu al analitului, trebuie să fie de minimum 50. În cazul în care nu există corespondenţă exactă cu un pic adecvat, regiunea corespunzătoare din spectrul analitului trebuie să corespundă prezenţei unui pic de acelaşi nivel. Procedeul se aplică numai picurilor de absorbţie din spectrul probei avînd o intensitate de cel puţin trei ori mai mică decît înălţimea zgomotului de fond.
    2.3.5. Criterii de funcţionare şi alte cerinţe care se aplică în cazul determinării unui analit prin LC asociată cu alte tehnici de detecţie
    2.3.5.1. Separaţia cromatografică
    Se foloseşte un etalon intern în cazul în care este disponibil materialul corespunzător. De preferinţă, este un etalon înrudit, cu timp de retenţie apropiat de acela al analitului. Analitul trebuie să elueze în timpul de retenţie caracteristic etalonului relevant în aceleaşi condiţii experimentale. Timpul de retenţie minimum admisibil pentru un analit trebuie să fie de două ori timpul de retenţie corespunzător volumului coloanei fără umplutură. Raportul între timpul de retenţie al analitului şi cel al etalonului intern, adică timpul de retenţie relativ al analitului, trebuie să fie egal cu cel al etalonului în matricea corespunzătoare, cu o marjă de ± 2,5 %.
    2.3.5.2. Detecţia ultravioletă/lumină vizibilă (UV/VIS) cu baleiaj complet
    Trebuie îndeplinite criteriile de funcţionare care se aplică metodelor LC.
    Maximele de absorbţie în spectru ale analitului trebuie să prezinte aceeaşi lungime de undă ca şi etalonul, cu o marjă determinată de rezoluţia sistemului de detecţie. Pentru detecţia cu şir de diode, această valoare se situează în mod obişnuit într-un interval de ± 2 nm. Pentru sectoarele celor două spectre ale căror absorbanţă relativă este egală cu sau mai mare decît 10 %, spectrul analitului peste 220 nm nu trebuie să aibă un aspect vizual diferit faţă de spectrul etalonului. Acest criteriu este îndeplinit în cazul în care, în primul rînd, sînt prezente aceleaşi maxime şi, în al doilea rînd, în cazul în care diferenţa între cele două spectre nu este, în nici un punct observat, mai mare de 10 % din absorbanţa caracteristică etalonului. În cazul în care se fac cercetări şi comparaţii cu baza de date, comparaţia datelor spectrale ale probelor de testare cu acelea ale soluţiei de etalonare trebuie să depăşească un factor de corespondenţă critic. Acest factor se determină în timpul procedurii de validare pentru fiecare analit în baza spectrelor pentru care sînt respectate criteriile menţionate anterior. Se verifică variabilitatea spectrelor indusă de matrice şi de aplicarea detectorului.
    2.3.5.3. Criterii de funcţionare care se aplică detecţiei fluorimetrice
    Trebuie respectate criteriile de funcţionare care se aplică metodelor LC.
    Aceasta se aplică moleculelor cu fluorescenţă naturală şi moleculelor care prezintă fluorescenţă după transformare sau derivatizare. Alegerea lungimilor de undă de excitaţie şi de emisie în combinaţie cu condiţiile cromatografice trebuie efectuată astfel încît să se reducă la minimum apariţia componenţilor interferenţi în extractele din blancuri.
    Maxima picului celui mai apropiat în cromatogramă este distanţată de picul analitului la cel puţin o lărgime totală de pic măsurată la 10 % din înălţimea maximă a picului analitului.
    2.3.5.4. Criterii de funcţionare care se aplică determinării unui analit prin imunograma LC
    Imunograma LC ca atare nu este potrivită ca metodă de confirmare.
    Trebuie respectate criteriile de funcţionare care se aplică metodelor LC.
    Parametrii predefiniţi de control al calităţii, de exemplu fixarea nonspecifică sau fixarea relativă a probelor de control sau valoarea absorbanţei blancului, se definesc în limitele obţinute în cursul validării analizei.
    Imunograma se compune din cinci fracţii cel puţin.
    Fiecare fracţie este mai mică decît jumătate din lărgimea picului.
    Fracţia cu conţinut maxim de analit trebuie să fie identică pentru proba suspectă, proba de control neconformă şi etalon.
    2.3.5.5. Determinarea unui analit prin LC cu detecţie UV/VIS (unică lungime de undă)
    LC cu detecţie UV/VIS (unică lungime de undă) ca atare nu este potrivită ca metodă de confirmare.
    Maxima picului celui mai apropiat în cromatogramă este distanţată de picul analitului la cel puţin o lărgime totală de pic măsurată la 10 % din înălţimea maximă a picului analitului.
    2.3.6. Criteriile de funcţionare şi alte cerinţe care se aplică la determinarea unui analit prin 2-D TLC cuplată cu detecţia spectrometrică UV/VIS cu baleiaj complet
    Sînt obligatorii HPTLC bidimensională şi co-cromatografia.
    Valorile RF ale analitului trebuie să corespundă valorilor RF ale etaloanelor, cu o marjă de ± 5 %.
    Aspectul analitului nu trebuie să se poată distinge de acela al etalonului.
    Pentru spoturile de aceeaşi culoare, centrul celui mai apropiat spot trebuie să fie depărtat de centrul spotului de analit la o distanţă egală cu cel puţin jumătate din suma diametrelor spoturilor.
    Spectrul analitului nu trebuie să aibă un aspect vizual diferit de cel al analitului etalon, în conformitate cu descrierea detecţiei UV/VIS cu baleiaj complet.
    În cazul în care se fac cercetări şi comparaţii într-o bibliotecă, comparaţia datelor spectrale ale probelor de testare cu acelea ale soluţiei de etalonare trebuie să depăşească un factor de corespondenţă critic. Acest factor se determină în timpul procedurii de validare pentru fiecare analit în baza spectrelor pentru care sînt respectate criteriile menţionate anterior. Se verifică variabilitatea spectrelor indusă de matrice şi de aplicarea detectorului.
    2.3.7. Criteriile de funcţionare şi alte cerinţe care se aplică la determinarea unui analit prin GC cu detecţie prin captură de electroni
    Se utilizează un etalon intern în cazul în care este disponibil materialul corespunzător. De preferinţă, este o substanţă înrudită, cu timp de retenţie apropiat de cel al analitului. Analitul trebuie să elueze în timpul de retenţie caracteristic etalonului corespondent, în aceleaşi condiţii experimentale. Timpul de retenţie minim admisibil pentru un analit trebuie să fie de două ori timpul de retenţie corespunzător volumului coloanei fără umplutură. Raportul între timpul de retenţie al analitului şi cel al etalonului intern, adică timpul de retenţie relativ al analitului, trebuie să fie egal cu cel al etalonului în matricea corespunzătoare, cu o marjă de ± 0,5 %.         Maxima picului celui mai apropiat în cromatogramă este distanţată de picul analitului la cel puţin o lărgime totală de pic măsurată la 10 % din înălţimea maximă a picului analitului. Se poate folosi o co-cromatogramă pentru a obţine informaţii suplimentare.
    2.4. Metode de confirmare care se aplică elementelor
    Analizele de confirmare pentru elementele chimice se întemeiază pe conceptul de identificare univocă şi de cuantificare exactă şi precisă prin intermediul proprietăţilor fizico-chimice caracteristice ale elementului chimic considerat (de exemplu, lungimea de undă a radiaţiei emise sau absorbite, masa atomică) la nivelul considerat.
    Se apreciază că următoarele metode sau combinaţii de metode sînt corespunzătoare pentru identificarea elementelor chimice incluse în tabelul nr. 7.
Tabelul nr. 7

Metode corespunzătoare de confirmare pentru elementele chimice

Tehnica
Parametrul măsurat

Voltametrie anodică de stripping cu impuls diferenţial (DPASV)

Spectrometrie de absorbţie atomică (AAS)

Flacără
Generare de hidruri
Vapori la rece

Atomizare electrotermică (cuptor de grafit)

Spectrometrie de emisie atomică (AES)

Plasmă cu cuplaj inductiv
Spectrometrie de masă (MS)
Plasmă cu cuplaj inductiv
Semnal electric
 
 
Lungime de undă de absorbţie
Lungime de undă de absorbţie
Lungime de undă de absorbţie
Lungime de undă de absorbţie
 
Lungime de undă de emisie
 
Raportul masă/sarcină (m/z)
   
    2.4.1. Criteriile comune de funcţionare şi alte cerinţe care se aplică metodelor de confirmare
    Materialul de referinţă sau cel îmbogăţit, conţinînd cantităţi cunoscute de analit, un nivel apropiat sau la nivelul limitei maxime autorizate sau al limitei de decizie (probă controlată neconformă), precum şi materialele de control conforme şi blancurile de reactivi se analizează de preferinţă în acelaşi timp cu fiecare lot de probe de testare analizat, aplicînd metoda completă. Se recomandă să se injecteze extractele în instrumentul de încercări în ordinea următoare: blanc de reactiv, probă de control conformă, probă de confirmat, altă probă de control conformă şi, în final, probă de control neconformă. Orice altă ordine trebuie justificată.
    Ca regulă generală, cea mai mare parte a tehnicilor de încercări impun digestia completă a matricei organice pentru a obţine soluţii înainte de determinarea analitului. Aceasta poate fi obţinută cu ajutorul procedurilor de mineralizare cu microunde, care reduc la minimum riscul de pierdere şi/sau contaminare a analiţilor în cauză. Se utilizează recipiente de teflon decontaminate de bună calitate. În cazul în care se utilizează alte metode de digestie umedă sau uscată, trebuie să existe probe identificabile care să permită excluderea posibilelor fenomene de pierdere sau contaminare. În locul digestiei, procedurile de separare (de exemplu, extracţia) pot, în anumite condiţii, să fie reţinute pentru a separa analiţii de elementele componente ale matricei şi/sau pentru a concentra analiţii cu scopul de a-i introduce în echipamentul de încercări.
    În ceea ce priveşte etalonarea, fie externă, fie bazată pe metoda adaosului etalonat, este recomandabil să se ia măsuri pentru a nu depăşi zona de acţiune stabilită pentru analiză. În cazul etalonării externe, este obligatoriu ca etaloanele să fie preparate într-o soluţie a cărei compoziţie să fie cît mai apropiată posibil de aceea a soluţiei probei. De asemenea, corecţia de fond trebuie aplicată în cazul în care o impun condiţiile de încercări specifice.
    2.4.2. Criteriile de funcţionare şi alte cerinţe suplimentare care se aplică metodelor cantitative
    2.4.2.1. Precizia metodelor calitative
    În cazul analizelor repetate pe un material de referinţă certificat pentru elemente chimice, deviaţia conţinutului mediu determinat experimental de la valoarea certificată trebuie să se situeze în limita de ± 10 %. În cazul în care nu este disponibil nici un material de referinţă cerificat (CRM) de acest tip, se poate admite ca precizia măsurătorilor să fie evaluată prin recuperarea adaosurilor de element în cantităţi cunoscute la probe necunoscute. Trebuie observat că, spre deosebire de analit, elementul adăugat nu este legat chimic în matricea reală şi, prin urmare, rezultatele obţinute prin această metodă au o validitate mai slabă decît rezultatele obţinute la utilizarea CRM. Datele de recuperare sînt admisibile numai în cazul în care se situează în limita a ± 10 % din valoarea ţintă.
    2.4.2.2. Fidelitatea metodelor cantitative
    În cazul unor analize repetate pe o probă, efectuate în condiţii de reproductibilitate intralaborator, coeficientul de variaţie (CV) intralaborator al mediei nu trebuie să depăşească valorile menţionate în tabelul nr. 8.

Tabelul nr. 8

CV pentru metodele cantitative

într-o plajă de fracţii masice ale elementului

Fracţia masică
CV (%)
≥ 10 μg/kg pînă la 100 μg/kg

> 100 μg/kg pînă la 1000 μg/kg

≥ 1000 μg/kg
20
15
10
     
    2.4.3. Cerinţele specifice care se aplică în voltametria anodică de stripping cu impuls diferenţial
    Distrugerea completă a materiilor organice în probe înainte de dozarea cu DPASV este de cea mai mare importanţă. În voltamograme nu trebuie să fie vizibil nici un semnal larg rezultat din prezenţa materiilor organice. Nivelul picurilor în DPASV poate fi influenţat de constituenţii anorganici ai matricei. Prin urmare, cuantificarea trebuie efectuată prin metoda adaosurilor etalonate. Odată cu metoda se furnizează specimene de voltamograme tipice ale unei soluţii etalon.
    2.4.4. Cerinţele specifice aplicabile spectrometriei de absorbţie atomică (AAS)
    Această tehnică este prin esenţă o tehnică monoelement şi necesită în consecinţă optimizarea condiţiilor experimentale, în funcţie de elementul cuantificat. În măsura posibilităţilor, rezultatele trebuie să facă obiectul unei verificări calitative şi cantitative, recurgînd la alte linii de absorbţie (în mod ideal, se selecţionează două linii de absorbţie diferite). Etaloanele se prepară într-o matrice lichidă cît mai apropiată posibil de lichidul de măsurat (de exemplu, în termeni de concentraţie de acid sau de compoziţia agenţilor de modificare). Pentru a reduce la minimum valorile de blanc, toţi reactivii trebuie să fie de cea mai mare puritate posibilă. Pot fi demonstrate diferite tipuri de AAS, în funcţie de metoda aleasă pentru vaporizarea şi/sau atomizarea probei.
    2.4.4.1. Cerinţele specifice care se aplică la AAS cu flacără
    Reglajele instrumentelor se optimizează pentru fiecare element. În special, este necesar să se controleze compoziţia şi debitele de gaz. Pentru a evita interferenţele din cauza absorbţiei de fond, se utilizează un corector cu sursă continuă. În cazul matricelor necunoscute, se verifică dacă este necesară o corecţie de fond.
    2.4.4.2. Cerinţele specifice care se aplică la AAS cu cuptor de grafit
    Contaminarea prezentă în laborator influenţează deseori precizia atunci cînd se lucrează la nivel de ultraurme în cuptorul de grafit. Prin urmare, este necesar să se folosească reactivi de puritate ridicată, apă demineralizată şi un material de plastic inert pentru manipularea probelor şi a etaloanelor. Este necesar să se optimizeze reglajele instrumentelor pentru fiecare element. În special, se controlează condiţiile de pretratare şi de atomizare (temperatură, timp) şi modificarea matricei.
    Lucrul în condiţii de atomizare izotermă (de exemplu, tub de grafit cu încălzire transversală cu platformă Lvov integrată) reduce influenţa matricei în ceea ce priveşte atomizarea analitului. Modificarea matricei combinată cu corecţia de fond Zeeman permite cuantificarea prin intermediul curbei de etalonare bazate pe măsurătoarea soluţiilor etalon apoase.
    2.4.5. Cerinţele specifice care se aplică spectrometriei de absorbţie atomică cu generare de hidruri
    Compuşii organici conţinînd elemente precum arsenic, bismut, germaniu, plumb, antimoniu, seleniu, staniu şi telur pot fi foarte stabile şi necesită descompunere prin oxidare pentru obţinerea unor rezultate corecte în privinţa conţinutului total de elemente. Prin urmare, se recomandă digestia prin microunde sau calcinarea la înaltă presiune în condiţii puternic oxidante. Trebuie acordată cea mai mare grijă conversiei complete şi reproductibile a elementelor în hidrurile respective.
    Formarea hidrurii de arsenic într-o soluţie de acid clorhidric cu NaBH4 depinde de starea de oxidare a arsenului (As III: formare rapidă, As V: formare mai lentă). Pentru a evita o pierdere de sensibilitate la determinarea As V prin tehnica de injecţie în flux, provocată de timpul scurt de reacţie din acest sistem, As V trebuie să fie redus la As III după descompunerea prin oxidare. Iodura de potasiu/acidul ascorbic sau cisteina sînt adecvate în acest scop. Blancurile, soluţiile etalon şi soluţiile de probă se tratează în acelaşi mod. Un sistem pe loturi permite determinarea a două tipuri de arsenic fără să influenţeze precizia. Din cauza perioadei de formare mai lungi a hidrurii de As V, etalonarea se efectuează prin integrarea suprafeţelor picurilor. Este necesar să se optimizeze reglajele instrumentelor. Este important ca fluxul de gaz care transferă hidrura la atomizor să fie controlat.
    2.4.6. Cerinţele specifice care se aplică spectrometriei de absorbţie atomică în fază de vapori la rece
    Vaporii la rece se utilizează numai cu mercur. În cazul pierderilor de mercur elementar prin volatilizare şi adsorbţie este necesară o atenţie deosebită pe tot parcursul analizei. Se evită atent contaminarea prin reactivi sau mediu.
    În cazul compuşilor organici conţinînd mercur este necesară o descompunere prin oxidare pentru obţinerea unor rezultate corecte în privinţa conţinutului total de mercur. Pentru descompunere este indicat să se folosească sisteme sigilate cu digestie prin microunde sau calcinare la înaltă presiune. Pentru curăţarea echipamentului în contact cu mercurul este necesară o atenţie specială.
    Tehnica de injecţie în flux oferă avantaje. Pentru limitele de decizie inferioare se recomandă adsorbţia mercurului elementar pe un adsorbant şi/sau platină urmată de desorbţie termică. Contactul adsorbantului sau al celulei cu umiditatea perturbă măsurarea mercurului şi trebuie evitat.
    2.4.7. Cerinţele specifice care se aplică spectrometriei de emisie atomică cu plasmă cuplată inductiv (ICP-AES)
    Spectrometria de emisie atomică cu plasmă cuplată inductiv este o metodă multielement care permite măsurarea simultană a mai multor elemente. Pentru a folosi ICP-AES, probele trebuie digerate dinainte, pentru a descompune matricele organice. Se utilizează sisteme sigilate cu digestie prin microunde sau calcinare la presiune înaltă. Pentru ca analiza ICP-AES să fie eficace sînt esenţiale etalonarea instrumentului şi alegerea elementelor sau a lungimilor de undă. Pentru etalonarea instrumentului, în cazul curbelor de etalonare lineare, este de obicei necesar să se măsoare soluţiile de etalonare numai pentru patru concentraţii, deoarece în general curbele de etalonare în ICP-AES sînt lineare pe patru pînă la şase ordine de mărime a concentraţiei. Etalonarea sistemului ICP-AES trebuie în mod normal să se efectueze cu un etalon multielement care trebuie preparat într-o soluţie conţinînd aceeaşi concentraţie de acid ca şi soluţia de măsurat. Pentru curba lineară trebuie verificate concentraţiile elementelor.
    Alegerea lungimilor de undă pentru măsurarea emisiei provenite de la analiţi este adecvată pentru concentraţiile elementelor care urmează să fie determinate. În cazul în care concentraţia unui analit iese din zona de acţiune a unei linii de emisie, se foloseşte altă linie de emisie. Linia de emisie cea mai sensibilă (fără interferenţe) se alege prima, urmată de o linie mai puţin sensibilă. În cazul în care se lucrează la limita de detecţie sau în proximitate, cea mai bună alegere este de obicei linia de emisie cea mai sensibilă pentru analitul corespondent. În ICP-AES, principalele dificultăţi provin din interferenţele spectrale sau de fond. Interferenţele posibile sînt, de exemplu, decalajul de zgomotul de fond, derivata zgomotului de fond, o rezoluţie spectrală slabă şi variaţiile aleatoare ale zgomotului de fond. Fiecare interferenţă are propriile cauze şi remedii. Se aplică, în funcţie de matrice, corecţia interferenţelor şi optimizarea parametrilor de funcţionare. Unele interferenţe pot fi evitate prin diluarea sau prin adaptarea matricelor. Pentru fiecare lot de probe de testare analizat, materialul de referinţă şi cel îmbogăţit, conţinînd cantităţi cunoscute de analit sau de analiţi, precum şi blancul se tratează în acelaşi mod ca şi proba de testare. Pentru a controla posibile deviaţii, etalonul trebuie verificat după 10 probe. Toţi reactivii şi gazul plasmă trebuie să fie de cea mai mare puritate posibilă.
    2.4.8. Cerinţele specifice care se aplică spectrometriei de masă cu plasmă cuplată inductiv (ICP-MS)
    Determinarea urmelor de elemente cu masă atomică medie, cum sînt cromul, cuprul şi nichelul, poate fi grav perturbată de alţi ioni izobari şi poliatomici. Acest fenomen este evitabil numai în cazul în care este disponibilă o putere de rezoluţie de cel puţin 7000-8000. Dificultăţile asociate cu tehnicile de MS sînt în special deviaţiile instrumentului, efectele matricei şi perturbaţiile ionice moleculare (m/z < 80). Este necesară etalonarea internă multiplă acoperind aceeaşi plajă de mase ca şi ementele de determinat pentru a corecta deviaţia instrumentului şi efectele matricei.
    Este necesar ca descompunerea completă a materiilor organice în probe să se producă înainte de măsurarea prin ICP-MS. Ca şi la AAS, după digestia în recipiente sigilate, elementele volatile, de exemplu iodul, trebuie să fie transferate într-o stare de oxidare stabilă. Interferenţa cea mai importantă rezultă din combinaţiile ionice moleculare ale argonului (gazul plasmă), ale hidrogenului, ale carbonului, ale azotului şi ale oxigenului (acizi de disoluţie, impurităţi ale plasmei şi gazelor atmosferice antrenate) şi ale matricei probei. Digestia completă, măsurătorile fondului, alegerea corespunzătoare a maselor analizate, asociate uneori cu o abundenţă inferioară (limită de detecţie mai slabă) şi a acizilor de descompunere, de exemplu acidul azotic, sînt indispensabile pentru a evita interferenţele.
    Pentru elementele de determinat, interferenţele se exclud prin alegerea corespunzătoare a maselor analizate specifice, inclusiv confirmarea rapoartelor izotopilor. Răspunsul instrumentului se verifică ţinînd seama de factorii Fano pentru fiecare măsurătoare, folosind etaloane interne.
3. Validarea
    Validarea trebuie să demonstreze că metoda de încercări este în conformitate cu criteriile aplicabile în cazul caracteristicilor de funcţionare relevante.
    Controale cu scopuri diferite necesită categorii diferite de metode. Tabelul nr.9 determină caracteristica de funcţionare care se verifică prin fiecare tip de metodă.
Tabelul nr. 9

Clasificarea metodelor de încercări după caracteristicile

de funcţionare care urmează să fie determinate

 
Limita de detecţie CCβ
Limita de decizie CCα
Precizie/
Recuperare
Fidelitate
Selectivitate/ Specificitate
Aplicabilitate/
Robusteţe/
Stabilitate
Metode calitative
S
+
+
+
C
+
+
+
+
Metode cantitative
S
+
+
+
+
C
+
+
+
+
+
+

S = metode de depistare; C = metode de confirmare; + = determinare obligatorie


    3.1. Proceduri de validare
    Prezentul capitol conţine exemple şi/sau trimiteri privind procedurile de validare ale metodelor de încercări. Se pot folosi şi alte abordări pentru a demonstra că metoda de încercări respectă criteriile care se aplică în cazul caracteristicilor de funcţionare, în măsura în care furnizează o cantitate şi o calitate echivalentă de informaţii.
    Validarea poate fi, de asemenea, efectuată procedînd la un studiu interlaboratoare definit de Codex alimentarius, ISO sau IUPAC sau prin alte metode, precum studiile intralaborator sau validarea internă. Prezentul capitol se concentrează asupra studiilor intralaborator (sau validare internă) şi adoptă o abordare modulară. Această abordare constă în:
    1) un set de caracteristici de funcţionare comune, independente de modelul de validare folosit);
    2) proceduri specifice legate de model, în conformitate cu descrierea din tabelul nr. 10.
Tabelul nr. 10

Parametri de funcţionare independenţi şi dependenţi de model

Validare
Parametri de funcţionare independenţi de model
Parametri de funcţionare dependenţi de model
Caracteristici de funcţionare comune (3.1.1.)
Validare clasică (3.1.2.)
 Validare internă (3.1.3)
Specificitate
Precizie

Robusteţe: variaţii minore

 
Stabilitate
Recuperare
Repetabilitate

Reproductibilitate intralaborator

Repetabilitate

Limită de decizie (CCα)

Capacitate de detecţie (CCβ)

Curbă de etalonare

Robusteţe: variaţii semnificative

Recuperare
Repetabilitate

Reproductibilitate intralaborator

Repetabilitate

Limită de decizie (CCα)

Capacitate de detecţie (CCβ)

Curbă de etalonare

Robusteţe
   
    3.1.1. Caracteristicile de funcţionare independente de model
    Indiferent de abordarea aleasă pentru validare, trebuie determinate caracteristicile de funcţionare menţionate în continuare. Pentru a reduce munca, poate fi utilizată o abordare bine concepută şi validă din punct de vedere statistic, pentru a combina experienţele realizate în vederea determinării diferiţilor parametri.
    3.1.1.1. Specificitatea
    Pentru metodele de încercări este importantă capacitatea de demostrare între analit şi substanţe înrudite (izomeri, metaboliţi, produse de degradare, substanţe endogene, constituenţi ai matricei etc.). Sînt necesare două abordări pentru a verifica existenţa interferenţelor.
    În consecinţă, substanţele potenţial interferente se izolează şi se analizează probele blanc relevante, pentru a detecta existenţa eventualelor interferenţe şi a le estima efectele:
    se alege un set de compuşi chimic înrudiţi (metaboliţi, derivaţi etc.) sau alte substanţe care pot fi întîlnite în probă odată cu compusul respectiv;
    se analizează un număr corespunzător de probe blanc reprezentative (n ≥ 20) şi se controlează prezenţa interferenţelor (semnale, picuri, urme de ioni) în zona respectivă, unde se presupune că eluează analitul ţintă;
    de asemenea, se îmbogăţesc probe blanc reprezentative pînă la o concentraţie corespunzătoare cu substanţe care pot să interfereze cu identificarea şi/sau cuantificarea analitului;
    după analiză se observă dacă:
    a) prezenţa interferenţelor poate conduce la o falsă identificare;
    b) prezenţa uneia sau a mai multor interferenţe împiedică identificarea analitului ţintă;
    c) cuantificarea este sensibil influenţată.
    3.1.1.2. Precizia
    Prezentul punct descrie determinarea preciziei (care este un element al exactităţii). Precizia poate fi determinată numai prin intermediul unui material de referinţă certificat (CRM). Trebuie folosit un CRM în toate cazurile în care este disponibil. Metoda este descrisă în detaliu în ISO 5725-4. În continuare este prezentat un exemplu:
    se analizează 6 replici de CRM în conformitate cu instrucţiunile de testare care se aplică metodei,
    se determină concentraţia analitului prezent în fiecare probă de replică,
    se calculează media, deviaţia standard şi coeficientul de variaţie (%) pentru aceste concentraţii,
    se calculează precizia împărţind concentraţia medie detectată la valoarea certificată (măsurată în concentraţie) şi se înmulţeşte cu 100, pentru a exprima rezultatul în procente.
    Precizia (%) = concentraţia medie detectată corectată cu recuperarea × 100/valoare certificată.
    În absenţa CRM, se poate determina recuperarea în loc de precizie.
    3.1.1.3. Aplicabilitatea/robusteţea (variaţii minore)
    Acest tip de experienţă recurge la introducerea deliberată, în laborator, a unor variaţii minore rezonabile şi la observarea consecinţelor acestora.
    Studiile prealabile trebuie să fie realizate alegînd factorii de pretratare, de purificare şi de încercări a probei care pot influenţa rezultatele măsurărilor. Aceşti factori pot să fie utilizatorul, sursa şi vechimea reactivilor, solvenţii, etaloanele şi extractele de etalon, viteza de încălzire, temperatura, pH-ul şi numeroşi alţi factori care pot apărea în laborator. Ei trebuie modificaţi cu un ordin de mărime corespunzător deviaţiilor întîlnite de obicei între diferite laboratoare.
    Se identifică eventualii factori care pot influenţa rezultatele.
    Se variază uşor fiecare factor.
    Se efectuează un test de robusteţe după metoda Youden  (la etapa respectivă pot fi folosite şi alte metode acceptate. Cu toate acestea, abordarea Youden reduce la minimum timpul şi munca necesară). Abordarea Youden este un model factorial fracţionat. Interacţiunile între diferiţi factori nu sînt detectabile.
    În cazul în care un factor influenţează în mod semnificativ rezultatele măsurărilor, se realizează experienţe suplimentare, pentru a determina limitele de acceptabilitate ale acestui factor.
    Factorii care influenţează rezultatele în mod semnificativ trebuie identificaţi cu claritate în protocolul de test.
    Conceptul de bază nu este studierea unei variaţii o singură dată, ci introducerea mai multor variaţii simultan. De exemplu, să desemnăm cu A, B, C, D, E, F şi G valorile nominale a 7 factori diferiţi, care pot influenţa rezultatele în cazul în care valorile lor nominale sînt uşor modificate. Să desemnăm celelalte valori ale aceloraşi factori cu literele minuscule corespondente a, b, c, d, e, f şi g. Rezultă 27 sau 128 de potenţiale combinaţii diferite.
    Este posibil să se aleagă un subset de opt dintre aceste combinaţii, care prezintă un echilibru între majuscule şi minuscule (tabelul nr. 11). Se efectuează opt determinări, utilizînd cîte o combinaţie de factori aleşi (A-G). Rezultatele determinărilor sînt prezentate la literele S–Z din tabelul nr. 11.
Tabelul nr. 11

Planul de experimentare

pentru studiile de robusteţe (variaţii minore)

Valoarea factorului F
Numărul combinaţiilor de determinări
 
1
2
3
4
5
6
7
8
A/a
B/b
C/c
D/d
E/e
F/f
G/g
A
B
C
D
E
F
G
A
B
c
D
e
f
g
A
B
C
d
E
f
g
A
B
c
d
e
F
G
A
B
C
d
e
F
g
A
B
c
d
E
f
G
A
B
C
D
e
f
G
A
B
c
D
E
F
g
Rezultat observat R
S
T
U
V
W
X
Y
Z

Pentru calcule, a se vedea exemplele de teste de robusteţe la punctul 3.3.


    3.1.1.4. Stabilitatea
    S-a observat că o stabilitate insuficientă a analitului sau a constituenţilor matricei în probă pe parcursul depozitării sau al analizei ar putea produce deviaţii semnificative la nivelul rezultatului analizei. Este necesar, de asemenea, să se controleze stabilitatea etalonului în soluţie. În general, stabilitatea analitului este bine caracterizată în diferite condiţii de depozitare. Controlul condiţiilor de depozitare va face parte din sistemul normal de autorizare a laboratoarelor. În cazul în care stabilitatea nu este cunoscută, ea poate fi determinată în conformitate cu exemplele menţionate în continuare.
    Stabilitatea analitului în soluţie
    Se prepară soluţii de bază proaspete de analit (analiţi) şi se diluează în conformitate cu instrucţiunile de testare, pentru a obţine părţi alicote în număr suficient (de exemplu, patruzeci) din fiecare concentraţie aleasă (aproape de limita de funcţionare minimă necesară substanţelor pentru care nu a fost stabilită nici o limită autorizată sau în apropiere de limita autorizată pentru celelalte substanţe). Se prepară soluţii de analit utilizate la îmbogăţire şi în soluţia finală, precum şi orice altă soluţie de interes (de exemplu, etaloane derivate).
    Se măsoară conţinutul în analit în soluţia proaspăt preparată în conformitate cu instrucţiunile de testare.
    Se toarnă volume adecvate în recipiente adaptate, se etichetează şi se depozitează în conformitate cu următorul plan:
Tabelul nr. 12

Plan de determinare a stabilităţii analitului în soluţie

 
–20 °C
+4 °C
+20 °C
Umbră
lumină
10 părţi alicote
10 părţi alicote
10 părţi alicote
10 părţi alicote
  
    Timpul de depozitare fixat este de 1, 2, 3 şi 4 săptămîni sau mai mult, în cazul în care este necesar, de exemplu, pînă în momentul în care sînt observate primele fenomene de degradare pe parcursul identificării şi/sau cuantificării. Timpul de depozitare maxim şi condiţiile optime de depozitare se consemnează.
    Calculul concentraţiei de analit (analiţi) în fiecare parte alicotă se efectuează luînd în considerare drept concentraţie 100 % soluţia de analit preparat proaspăt, la momentul analizei.
    Analit rezidual % = Ci × 100/Cproaspăt
    Ci = concentraţia la momentul considerat;
    Cproaspăt = concentraţia unei soluţii proaspete.
    Stabilitatea analitului sau a analiţilor în matrice
    În măsura în care este posibil, se folosesc probe contaminate în mod natural. În lipsa materialului contaminat natural, este recomandabil să se folosească o matrice îmbogăţită cu analit.
    Cu un material contaminat natural, se determină concentraţia în material, în timp ce acesta este încă proaspăt. Se prelevează şi alte părţi alicote după 1, 2, 4 şi 20 de săptămîni şi se determină concentraţiile.
    Materialul trebuie depozitat la minimum 20 °C sau la o temperatură inferioară, în cazul în care este necesar.
    În absenţa materialului contaminat natural, se prelevează material care nu conţine analit şi se omogenizează. Se împarte materialul în 5 părţi alicote. Se adaugă la fiecare parte alicotă analitul, de preferinţă preparat într-o cantitate mică de soluţie apoasă. Imediat se analizează o parte alicotă. Se depozitează părţile alicote rămase la cel puţin –20 °C sau la o temperatură inferioară în cazul în care este necesar şi se analizează după 1,2, 4 şi 20 de săptămîni.
    3.1.1.5. Curbele de etalonare
    În cazul în care curbele de etalonare sînt utilizate pentru cuantificare:
    se utilizează cel puţin cinci niveluri (inclusiv zero) pentru a construi curba;
    se descrie zona de acţiune a curbei de etalonare;
    se descrie modelul matematic al curbei şi ajustarea datelor la curbă;
    se descriu plajele de acceptabilitate a parametrilor curbei.
    În cazul în care este necesară o etalonare în serie bazată pe o soluţie etalon, plajele admisibile trebuie indicate pentru acei parametri ai curbei de etalonare care pot varia de la o serie la alta.
    3.1.2. Proceduri clasice de validare
    Pentru calculul parametrilor după metodele clasice este necesară realizarea mai multor experimente. Fiecare caracteristică de funcţionare trebuie să fie determinată pentru fiecare variaţie importantă (a se vedea menţiunile anterioare de la aplicabilitate/robusteţe). Pentru metodele multianalit, pot fi analizaţi simultan mai mulţi analiţi în cazul în care eventualele interferenţe relevante sînt îndepărtate în prealabil. Mai multe caracteristici de funcţionare pot fi determinate în acelaşi mod. Astfel, pentru a reduce munca, se recomandă combinarea pe cît posibil a experienţelor (de exemplu, repetabilitatea şi reproductibilitatea intralaborator cu specificitatea, analiza blancurilor pentru determinarea limitei de decizie şi testul de specificitate).
    3.1.2.1. Recuperarea
    În absenţa CRM, recuperarea se determină prin experienţe cu blanc de matrice îmbogăţit, aplicînd, de exemplu, următorul plan:
    se aleg 18 părţi alicote dintr-un blanc de material şi fiecare grup de 6 părţi alicote se îmbogăţeşte cu 1, 1,5 şi 2 ori limita de funcţionare minimă cerută sau cu 0,5, 1 şi 1,5 ori limita autorizată,
    se analizează probele şi se calculează concentraţia prezentă în fiecare probă;
    cu ajutorul ecuaţiei menţionate în continuare se calculează recuperarea pentru fiecare probă,
    se calculează recuperarea medie şi CV pentru cele şase rezultate de la fiecare nivel, de unde rezultă că % recuperare = 100 × conţinutul măsurat/nivel de îmbogăţire.
    Această metodă clasică de determinare a recuperării este o variantă a metodei adaosurilor etalonate descrise la punctul 3.5 în cazul în care:
    proba este considerată ca blanc, în loc de probă de analizat,
    se consideră că randamentul şi recuperarea sînt identice pentru cele două fracţii de analizat,
    probele de testare au aceleaşi mase şi extractele fracţiei de analizat au aceleaşi volume,
    cantitatea de etalon adăugată în a doua fracţie de analizat (îmbogăţită) se notează cu xADD (xADD = ρA • VA),
    x1 este valoarea măsurată pentru blanc şi x2 valoarea măsurată pentru a doua fracţie de analizat (îmbogăţită),  de unde rezultă că % recuperare = 100 (x2 – x1)/xADD.
    În cazul în care oricare dintre condiţiile de mai sus nu este (sau se presupune că nu este) îndeplinită, trebuie efectuată procedura completă pentru determinarea recuperării prin metoda adaosurilor etalonate, descrisă la punctul 3.5.
    Notă: Randament: fracţia din masa analitului conţinută în probă care este prezentă în extractul final.
    Recuperare (aici): fracţia din masa analitului adăugată la probă care este prezentă în extractul final. În continuarea prezentului document, se consideră că randamentul şi recuperarea sînt identice şi se foloseşte numai termenul “recuperare”.
    3.1.2.2. Repetabilitatea
    Se prepară un set de probe de matrice identice, îmbogăţite cu analit, astfel încît să se obţină concentraţii echivalînd cu 1, 1,5 şi 2 ori limita de funcţionare minimă cerută sau cu 0,5, 1 şi 1,5 ori limita autorizată.
    La fiecare nivel, analiza trebuie realizată cu minimum şase replici.
    Se analizează probele.
    Se calculează concentraţia detectată în fiecare probă.
    Se determină concentraţia medie, deviaţia standard şi coeficientul de variaţie (%) ale probelor îmbogăţite.
    Se repetă aceste operaţiuni cel puţin de încă două ori.
    Se calculează totalul concentraţiilor medii şi ale CV pentru probele îmbogăţite.
    3.1.2.3. Reproductibilitate intralaborator
    Se prepară un set de probe din materialul de testare specificat (matrice identice sau diferite) îmbogăţite cu analit sau analiţi, astfel încît să se obţină concentraţii echivalente cu 1, 1,5 şi 2 ori limita de funcţionare minimă cerută sau cu 0,5, 1 şi 1,5 ori limita autorizată.
    La fiecare nivel, analiza trebuie realizată cu minimum şase replici.
    Se repetă aceste operaţiuni de încă două ori cel puţin cu utiliizatori diferiţi, în medii diferite, de exemplu, loturi diferite de reactivi, de solvenţi etc. la temperaturi ambiante diferite, cu instrumente diferite etc., în cazul în care este posibil.
    Se analizează probele.
    Se calculează concentraţia detectată în fiecare probă.
    Se determină concentraţia medie, deviaţia standard şi coeficientul de variaţie (%) ale probelor îmbogăţite.
    3.1.2.4. Reproductibilitatea
    În cazul în care trebuie verificată reproductibilitatea, laboratoarele trebuie să participe la studii în conformitate cu standardul ISO 5725-2.
    3.1.2.5. Limita de decizie (CCα)
    Limita de decizie se stabileşte în conformitate cu cerinţele în materie de identificare sau de identificare şi cuantificare definite de “Criteriile de funcţionare şi alte cerinţe care se aplică metodelor de încercări” (partea 2).
    În cazul substanţelor pentru care nu a fost stabilită nici o limită autorizată, limita de decizie poate fi determinată:
    fie prin metoda curbei de etalonare în conformitate cu standardul ISO 11843 (denumită aici valoare critică a variabilei de stare nete). În acest caz se utilizează mai multe probe blanc, îmbogăţite la nivelul de funcţionare minim cerut şi peste acest nivel, cu increment egal. Se analizează probele. După identificare, se reprezintă semnalul ca funcţie de concentraţia adăugată. Limita de decizie este egală cu concentraţia corespunzătoare interceptului y plus de 2,33 ori deviaţia standard a reproductibilităţii intralaborator a interceptului. Aceasta se aplică exclusiv determinărilor cantitative (α = 1 %);
    fie analizînd cel puţin 20 de materiale blanc pentru fiecare matrice, pentru a putea calcula raportul semnal-zgomot în fereastra în care este aşteptat analitul. Se poate utiliza ca limită de decizie valoarea echivalentă cu triplul raport semnal-zgomot. Această metodă se aplică determinărilor cantitative şi calitative.
    În cazul substanţelor pentru care este stabilită o limită autorizată, limita de detecţie poate fi determinată:
    fie prin metoda curbei de etalonare (denumită aici valoare critică a variabilei de stare nete), în conformitate cu standardul ISO 11843. În acest caz se folosesc mai multe probe blanc, îmbogăţite la un nivel apropiat de limita autorizată cu increment egal. Se analizează probele. După identificare se reprezintă semnalul ca funcţie de concentraţia adăugată. Limita de decizie este egală cu concentraţia corespunzătoare limitei autorizate plus de 1,64 ori deviaţia standard a reproductibilităţii intralaborator (α = 5 %),
    fie analizînd cel puţin 20 de materiale blanc pentru fiecare matrice, îmbogăţite cu analit sau analiţi la limita autorizată. Limita de decizie este egală cu concentraţia la limita autorizată plus de 1,64 ori deviaţia standard corespunzătoare (α = 5 %).
    3.1.2.6. Capacitatea de detecţie (CCβ)
    Limita de detecţie se determină în conformitate cu cerinţele în materie de depistare, de identificare sau de identificare şi de cuantificare definite de partea 2.
    În cazul substanţelor pentru care nu a fost stabilită nici o limită autorizată, limita de decizie poate fi determinată:
    prin metoda curbei de etalonare (denumită aici valoare minimă detectabilă a variabilei de stare nete), în conformitate cu standardul ISO 11843. În acest caz se utilizează material blanc reprezentativ, îmbogăţit la nivelul de funcţionare minim cerut şi peste acest nivel, cu increment egal. Se analizează probele. După identificare se reprezintă semnalul ca funcţie de concentraţia adăugată. Limita de detecţie este egală cu concentraţia corespunzătoare limitei de decizie plus 1,64 ori deviaţia standard a reproductibilităţii intralaborator pentru conţinutul mediu măsurat la limita de decizie (β = 5 %),
    analizînd cel puţin 20 de materiale blanc pentru fiecare matrice, îmbogăţite cu analit sau analiţii la limita de decizie. Se analizează probele şi se identifică analiţii. Limita de detecţie este egală cu valoarea limitei de decizie plus 1,64 ori deviaţia standard a reproductibilităţii intralaborator pentru conţinutul măsurat (β = 5 %),
    în absenţa rezultatelor cantitative, capacitatea de detecţie poate fi determinată prin studiul materialului blanc îmbogăţit la limita de decizie şi peste această limită. În acest caz, capacitatea de detecţie a metodei este egală cu nivelul de concentraţie la care nu mai rămîn decît 5 % sau mai puţin false rezultate conforme. Prin urmare, trebuie efectuate cel puţin 20 de teste la cel puţin un nivel de concentraţie în vederea obţinerii unei baze fiabile pentru această determinare.
    În cazul substanţelor pentru care s-a stabilit o limită autorizată, capacitatea de detecţie poate fi determinată:
    fie prin metoda curbei de etalonare (denumită aici valoare minimă detectabilă a variabilei de stare nete), în conformitate cu standardul ISO 11843. În acest caz se utilizează o probă blanc reprezentativă, îmbogăţită la nivelul de funcţionare minim cerut şi peste acest nivel, cu increment egal. Se analizează probele şi se identifică analitul (analiţii). Se calculează deviaţia standard a conţinutului mediu măsurat la limita de decizie.             Capacitatea de detecţie este egală cu concentraţia corespunzătoare valorii limitei de decizie plus 1,64 ori deviaţia standard a reproductibilităţii intralaborator (β = 5 %),
fie analizînd cel puţin 20 de materiale blanc pentru fiecare matrice, îmbogăţite cu analit sau analiţii la limita de decizie. Capacitatea de detecţie este egală cu valoarea limitei de decizie plus 1,64 ori deviaţia standard corespunzătoare (β = 5 %).
    3.1.2.7. Robusteţea (variaţii semnificative)
    Metoda de încercări trebuie testată în condiţii experimentale diferite, care cuprind în special specii diferite, matrice diferite sau condiţii de probă diferite. Variaţiile introduse trebuie să fie semnificative. Importanţa acestor variaţii poate fi evaluată folosind, de exemplu, abordarea Youden. Fiecare caracteristică de funcţionare trebuie determinată pentru toate variaţiile semnificative pentru care a fost demonstrat un efect important asupra desfăşurării testului.
    3.1.3. Validarea pe baza altor modele
    În cazul în care se aplică alte metode de validare, în protocolul de validare se definesc modelul şi strategia de bază cu cerinţele iniţiale, ipotezele şi formulele corespunzătoare sau, cel puţin, se fac trimiteri la acestea. În continuare este reluat un exemplu de metodă de înlocuire. Atunci cînd se aplică modelul de validare internă, de exemplu, caracteristicile de funcţionare se determină astfel încît să permită validarea pentru variaţiile semnificative în aceeaşi metodă de validare. Pentru aceasta este necesară definirea unui plan de experimentare pentru validare.
    3.1.3.1. Planul de experimentare
    În funcţie de numărul speciilor şi de diferiţi factori studiaţi, se stabileşte un plan de experimentare. Prin urmare, prima etapă a metodei de validare studiază populaţiile de probe, care apoi sînt analizate în laborator pentru a alege speciile cele mai importante şi factorii care pot influenţa rezultatele măsurării. Plaja de concentraţii se selecţionează apoi în funcţie de scop, în conformitate cu nivelul considerat.
    Exemplu:
    mai mulţi analiţi pot fi studiaţi simultan prin metoda de încercări în curs de validare,
    s-au identificat două variaţii ale factorului principal (A şi B). Factorii principali formează baza de combinare a nivelurilor factorilor. Aceşti factori principali pot să cuprindă factori precum specia sau matricea. În acest exemplu, factorul principal s-a modificat pe două niveluri, adică au fost luate în considerare două specii diferite (specia A şi specia B). În general, este posibil să poată fi modificaţi
    factorii principali pe mai mult de două niveluri, ceea ce nu face decît să mărească numărul de analize de efectuat, factorii aleşi se modifică pe două niveluri (indicate cu + sau –).
Tabelul nr. 13

Exemple de factori consideraţi ca fiind

importanţi pentru o metodă de validare

Sexul animalului
Rasa
Condiţiile de transport
Condiţiile de depozitare
Condiţiile de îngrăşare
Prospeţimea probei

Utiliizatori diferiţi avînd experienţă diferită

(factorul 1)
(factorul 2)
(factorul 3)
(factorul 4)
(factorul 5)
(factorul 6)
(factorul 7)
Tabelul nr. 14

Plan de experimentare

posibil pentru exemplul de mai sus

Specia
Factorul 1
Factorul 2
Factorul 3
Factorul 4
Factorul 5
Factorul 6
Factorul 7
Proba nr.
A
A
A
A
A
A
A
A
B
B
B
B
B
B
B
B
+
+
+
+
-
-
-
-
+
+
+
+
-
-
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
-
+
-
+
+
-
+
-
-
+
-
+
+
-
-
+
-
+
+
-
+
-
+
-
+
-
-
+
-
+
+
-
-
+
+
-
-
+
-
+
+
-
-
+
+
-
-
-
+
+
+
+
-
-
+
+
-
-
-
-
+
+
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
 
    Deoarece fiecare probă (fiecare combinaţie de niveluri de factori) trebuie îmbogăţită cu patru concentraţii diferite şi apropiate de nivelul de interes, iar o probă blanc trebuie analizată pentru fiecare nivel, rezultă că trebuie efectuate 5 × 16 = 80 de analize pentru setul de experienţe de validare.
    Aceste 80 rezultate de măsurare permit calcularea.
    Recuperare:
    repetabilitatea pe nivel de concentraţie (Sir);
    reproductibilitatea intralaborator pe nivel de concentraţie (SiR);
    limita de decizie (CCα);
    capacitatea de detecţie (CCβ);
    curba de putere (rata erorilor β în raport cu concentraţia, a se vedea punctul 3.1.2.3);
    robusteţea (variaţii semnificative); robusteţea pentru variaţiile minore poate fi determinată în conformitate cu punctul 3.1.1.3;
    16 curbe de etalonare legate de probă;
    1 curbă de etalonare globală;
    intervalul de predicţie al curbei de etalonare globală;
    deviaţiile induse de matrice (Smat);
    deviaţiile induse de desfăşurarea analizei (Srun);
    incidenţa diferiţilor factori asupra rezultatelor măsurărilor.
    Aceste caracteristici de funcţionare permit evaluarea completă a nivelului de funcţionare a metodei, dat fiind că sînt studiate nu numai influenţa diferiţilor factori, ci şi combinaţiile relevante ale acestor factori. Cu ajutorul acestui plan de experimentare, este posibil să se decidă dacă unul sau altul dintre factorii aleşi se exclude din curba de etalonare globală pentru că se îndepărtează semnificativ de deviaţiile standard ale celorlalţi factori.
    3.1.3.2. Curba de putere
    Curba de putere furnizează informaţii asupra capacităţii de detecţie a metodei în plaja de concentraţii aleasă. Ea face trimitere la riscul de eroare β atunci cînd se aplică metoda studiată. Curba de putere permite calcularea capacităţilor de detecţie pentru diferite categorii (depistare, confirmare) sau tipuri (calitativ sau cantitativ) de metode pentru o eroare β dată (de exemplu, 5 %).
 

Concentraţie
    Figura 1 prezintă un exemplu de reprezentare grafică a capacităţii de detecţie CCβ a unei metode de analiză. Această metodă are un risc rezidual de decizie falsă de 5% la concentraţia de 0,50 ug/kg. La concentraţia de 0,55 ug/kg, riscul de fals rezultat conform scade la 1 %.
    3.1.3.3 Reproductibilitatea
    Determinarea reproductibilităţii unei metode prin conceptul studiilor intralaborator (validare internă)
    necesită participarea la teste de aptitudini în conformitate cu ghidunle ISO 43-1 şi 43-2.
    Laboratoarele pot să îşi aleagă propriile metode, cu condiţia ca acestea să fie folosite în condiţii de rutină.
    Deviaţia standard a laboratorului poate fi folosită pentru a evalua reproductibilitatea metodei.

3.2 REPREZENTAREA GRAFICĂ A
DIFERITOR LIMITE DE ANALIZĂ




Răspuns
    Xc    Valoarea de răspuns medie a probei contaminate
    Sg    Deviaţia standard a probei blanc (determinată în condiţii de reproductibilitate intralaborator)
    Ss    Deviaţia standard a probei contaminate (determinată în condicii de reproductibilitate intralaborator)
    α    Rata falselor rezultate neconforme
    β    Rata falselor rezultate conforme
    CCα    Răspunsul cu α eroare dată şi o eroare β de 50 %
    CCβ    Răspunsul cu eroare α foarte mică şi o eroare β dată



Concentraţie
    Xg       „Concentraţia” medie a probei blanc
    XpL    Concentraţia medie a probei conţinînd analit la limita autorizată
    X c     Concentraţia medie a probei contaminate
    SpL    Deviaţia standard a probei conţinînd analit la limita autorizată (determinată în condiţii de reproductibilitate intralaborator)
    Ss        Deviaţia standard a probei contaminate (determinată în condiţii de reproductibilitate intralaborator)
    α         Rata falselor rezultate neconforme
    β         Rata falselor rezultate conforme
    CCα    Răspunsul cu o eroare α dată şi o eroare β de 50%
    CCβ    Răspunsul cu o eroare α foarte mică şi o eroare β dată
    3.3. Exemple de calcul pentru determinarea robusteţii metodei la variaţii minore în abordarea Youden
    Comparaţia mediilor (A)

AA = Σ(Ai)/4
AB  = Σ(Bi)/4
AC = Σ(Ci)/4
 

Se compară mediile majusculelor (de la AA la AG) cu mediile minusculelor corespondente (de la Aa la Ag). În cazul în care un factor are vreun efect, diferenţa va fi semnificativ mai mare decît diferenţele altor factori

AD = Σ(Di)/4
AE = Σ(Ei)/4
 

O metodă robustă nu trebuie să fie influenţată de variaţiile care se întîlnesc cu cvasicertitudine între laboratoare

AF = Σ(Fi)/4
AG = Σ(Gi)/4
Aa = Σ(ai)/4
Ab = Σ(bi)/4
Ac = Σ(ci)/4
Ad = Σ(di)/4
Ae = Σ(ei)/4
Af = Σ(fi)/4
Ag = Σ(gi)/4
 

În absenţa unei diferenţe excepţionale, măsurătoarea cea mai realistă a erorii aleatoare este dată de cele şapte diferenţe

Diferenţe (Di)
Pătratul diferenţelor, Di2
Da = A – a = Σ(Ai) – Σ(ai)
Db = B – b = Σ(Bi) – Σ(bi)
Dc = C – c = Σ(Ci) – Σ(ci)
Dd = D – d = Σ(Di) – Σ(di)
De = E – e = Σ(Ei) – Σ(ei)
Df = F – f = Σ(Fi) – Σ(fi)
Dg= G – g = Σ(Gi) – Σ(gi)
Da2 = valoarea a
Db2 = valoarea b
Dc2 = valoarea c
Dd2 = valoarea d
De2 = valoarea e
Df2 = valoarea f
Dg2 = valoarea g

    Deviaţia standard a diferenţelor Di (SDi):
SDi= √¯2*Σ(Di2/7)
    În cazul în care SDi este semnificativ mai mare decît deviaţia standard a metodei aplicate în condiţiile de reproductibilitate intralaborator (a se vedea mai sus), concluzia previzibilă este că toţi factorii consideraţi luaţi împreună au influenţă asupra rezultatului, chiar în cazul în care nici un factor izolat nu are influenţă semnificativă şi că metoda nu este suficient de robustă în raport cu variaţiile alese.
    3.4. Exemple de calcul pentru procedura de validare internă
    Exemple şi calcule pentru protocolul de validare internă descris la punctul 3.1.3. Validarea pe baza altor modele .
    3.5. Exemple de calcul pentru metoda adaosurilor etalonate
    O probă de testare cu un conţinut T de analit se împarte în două fracţii, 1 şi 2 de masă m1 şi m2. Fracţia 2 se îmbogăţeşte cu volumul VA dintr-o soluţie de concentraţie ρA de analit. După fazele de extracţie şi de purificare ale metodei se obţin două extracte din aceste fracţii, de volume V1 şi V2. Se consideră că recuperarea analitului este rc. Cele două extracte sînt testate cu o metodă de sensibilitate b şi dau răspunsurile analitice x1 şi respectiv x2.
    Presupunînd că rc şi b sînt identice pentru analit în proba originală şi în proba îmbogăţită, conţinutul T poate fi calculat după cum urmează:
T = x1 ·V1 ·ρA·VA/(x2·V2·m1-x1·V1·m2)
    Metoda permite determinarea recuperării rc. Apoi, în plus faţă de testul descris mai sus, o parte a extractului din fracţia 1 (volumul V3) se îmbogăţeşte cu o cantitate cunoscută ρBVB de analit şi se testează. Răspunsul analitic este x3 şi recuperarea:
    rc = x2·V1·V2·ρB·VB/[x3·V1·V3· (T·m2A·VA) - x2·V2·T·m1(V3 - VB)]
    Este, de asemenea, posibil să se calculeze sensibilitatea b după cum urmează:
    b = x1·V1/rc·T·m1
    Toate condiţiile de aplicare şi indicaţiile au fost descrise în literatura de specialitate.