OMAIAC159/2006
Внутренний номер: 321134
Varianta în limba de stat

Республика Молдова

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

ПРИКАЗ Nr. 159
от 07.07.2006

об утверждении ветеринарно-санитарных правил
в отношении некоторых методов анализа сырого
и термически обработанного молока

Опубликован : 23.02.2007 в Monitorul Oficial Nr. 25-28 статья № : 114

На основе положений Закона о ветеринарной деятельности № 1538-ХII от 23.06.93 г., в целях охраны здоровья людей, защиты интересов потребителя и в целях гармонизации ветеринарного законодательства Республики Молдова с ветеринарным законодательством Европейского Союза ПРИКАЗЫВАЮ:

1. Утвердить "Ветеринарно-санитарные правила в отношении некоторых методов анализа сырого и термически обработанного молока", гармонизированные в соответствии с требованиями Директивы ЕС 91/180/ЕЕС от 14.02.1991 г. (прилагаются).

2. Управлению ветеринарной медицины, Государственной ветеринарной инспекции, Республиканскому ветеринарно-диагностическому центру, районным и муниципальным ветеринарно-санитарным службам руководствоваться в своей деятельности положениями указанных ветеринарно-санитарных правил.

3. Настоящий приказ вступает в действие со дня опубликования в Официальном мониторе Республики Молдова.

4. Признать утратившим силу Приказ Министерства сельского хозяйства и пищевой промышленности № 162 от 30.06.2005 г. об утверждении "Ветеринарно-санитарных правил в отношении некоторых методов анализа сырого и термически обработанного молока".

5. Контроль за исполнением настоящего приказа возложить на Управление ветеринарной медицины, Государственную ветеринарную инспекцию.

МИНИСТР

СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И

ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ Анатолие ГОРОДЕНКО

№ 159. Кишинэу, 7 июля 2006 г.

Приложение

к Приказу Министерства сельского

хозяйства и пищевой промышленности

№ 159 от 7 июля 2006 г.

ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНЫЕ ПРАВИЛА

В ОТНОШЕНИИ НЕКОТОРЫХ МЕТОДОВ АНАЛИЗА СЫРОГО И

ТЕРМИЧЕСКИ ОБРАБОТАННОГО МОЛОКА

1. Базовые процедуры относительно использования методов исследования молока сырого:

а) определение точки замерзания;

b) oпределение общего количества микроорганизмов на плотном питательном агаре при 30oС;

c) определение количества соматических клеток;

d) определение остаточного количества антибиотиков и сульфаниламидов в сыром и термически обработанном молоке.

2. Базовые процедуры относительно использования методов исследования молока пастеризованного:

a) определение точки замерзания;

b) определение общего количества микроорганизмов на плотном питательном агаре при 30oС;

c) определение общего количества микроорганизмов на плотном питательном агаре при 21oС;

d) определение активности щелочной фосфотазы;

e) определение активности пероксидазы;

f) определение бактерий групп кишечной палочки в пастеризованном молоке при 30oС;

g) определение остаточного количества антибиотиков и сульфаниломидных.

3. Базовые процедуры относительно использования методов исследования молока UНТ:

a) определение точки замерзания;

b) определение общего количества микроорганизмов на плотном питательном агаре при 30oС;

c) определение остаточного количества антибиотиков и сульфаниламидов.

4. Исследование проводится по отобранным пробам согласно ветеринарно-санитарным нормам, описанным в приложении № 1.

5. Методы, перечисленные в пунктах 1, 2 и 3, описаны в приложении 2 к настоящим ветеринарно-санитарным правилам.

Приложение 1

к ветеринарно-санитарным правилам

в отношении некоторых методов анализа

сырого и термически обработанного молока

МЕТОДЫ ОТБОРА ПРОБ СЫРОГО
И ТЕРМИЧЕСКИ ОБРАБОТАННОГО МОЛОКА

1. Объекты и области применения

Метод применяется как к сырому молоку от производителя, так и к молоку, термически обработанному для непосредственного использования в розничной торговле.

2. Общее

Отбор проб сырого молока, а также термически обработанного из разных емкостей, производится авторизированным специалистом из аттестованной лаборатории, с соответствующей квалификационной подготовкой.

Компетентные органы, а также лаборатория, где проводятся анализы, инструктируют персонал, который осуществляет отбор проб, маркировку соответственно отобранных партий.

3. Приспособления для отбора

3.1. Общие правила

Приборы для отбора проб должны быть изготовлены из нержавеющей стали или покрыты антикоррозионным сплавом для пищевой промышленности в зависимости от цели (перемешивание, отбор и т. д.)

Приборы для перемешивания жидких продуктов должны иметь соответствующие размеры емкостей для достижения однородной массы и не допускать изменения вкуса.

Мутовка должна иметь ручку такой длины, чтобы при погружении отбор осуществлялся с любой точки емкости вместительностью минимум 50 мл. Отборные емкости, а также их крышки, должны быть изготовлены из стекла, металла или соответствующего пластика.

Сплавы, применяемые для изготовления пробоотборников, не должны сопутствовать каким-нибудь изменениям вкуса и качества продукта, во избежание некачественных результатов анализа.

Инвентарь, а также посуда, пробки и крышки для отбора проб должны быть чистыми, сухими, гладкими, с закругленными углами.

3.2. Пробоотборочный инвентарь для микробиологического анализа

Инвентарь (отборник емкости) должен соответствовать п. 3.1, а также быть стерильным.

Во избежание некачественных результатов анализа при отборе нескольких проб инвентарь каждый раз перед использованием должен быть простерилизован флалебированием или автоклавом по инструкциям лабораторий или компетентных органов.

4. Отбор проб продуктов

4.1. Общие правила.

В независимости от цели анализа перед отбором проводится тщательное перемешивание: ручное или механическое. Проба отбирается сразу же, пока молоко в движении. Если отбирается несколько проб для различных исследований, то для микробиологического анализа отбирается в первую очередь.

Количество проб должно соответствовать цели исследования. Отборные емкости должны быть изготовлены так, чтобы можно было наполнять их полностью, обеспечивая при этом хорошее перемешивание перед анализом, и чтобы при транспортировке они не бились.

4.2. Ручной отбор

4.2.1. Отбор из ведер и бидонов с молоком

Для более качественного перемешивания черпак движется сверху вниз, в ведре или бидоне, очень осторожно во избежание расплескивания молока и примыкания сметаны к горлу бидона. Отбор пробы из партии проводится по п. 4.2.4.

4.2.2. Отбор из холодильных ванн на ферме

Для однородной гомогенизации проводится механическое или ручное перемешивание. Если количество молока не способствует механическому перемешиванию, то проводится ручное.

4.2.3. Отбор из мерочных ванн

Перед переливом в мерочные ванны проводится перемешивание молока. Для наибольшей гомогенизации применяется механическое или ручное перемешивание.

Когда количество партии превосходит размеры мерочной ванны, отбирается общая проба из всей партии.

4.2.4. Отбор пробы из отдельной партии

Когда количество отобранного молока находится в нескольких емкостях, проба отбирается отдельно из каждой емкости и записывается количество молока, из которого произведен отбор пробы. Если исследование не проводится отдельно из каждой емкости, остается одинаковое количество молока из каждой емкости, пропорционально количеству молока, отобранного из той емкости, из которой отбирались эти порции молока. После перемешивания отбирается одна или больше проб из этих пропорциональных порций.

4.2.5. Отбор из больших коллекторных ванн, автоцистерн, вагонов-цистерн

4.2.5.1. До отбора проводится адекватное перемешивание. В больших коллекторных ваннах, автоцистернах, вагонах-цистернах проводится только механическое перемешивание. Длительность процесса зависит от времени отстоя молока. Процесс перемешивания должен соответствовать каждому случаю и цели исследования. От качества этого процесса зависит сходство исследований, проведенных по каждой пробе, отдельно отобранной из разных мест партии. Метод перемешивания молока (сырого или цельного) считается эффективным, если отличие количества жира между двумя пробами, отобранными в таких условиях, не превышает 0,1%.

В большой емкости с предусмотренным в нижней части отверстием имеется небольшое количества молока, отдельно от общего, даже после перемешивания. В таком случае отбор проводится через верхнее отверстие, а в отсутствие такого отбирается из нижнего, с предварительным сливом некоторого количества молока для обеспечения более правильного отбора пробы из общего перемешанного количества.

4.2.5.2 Перемешивание содержимого больших емкостей или коллекторных ванн, автоцистерн, вагонов-цистерн проводится:

- электромеханической мешалкой, помещенной в емкости;

- электромешалкой, помещенной в верхнее отверстие;

- в автоцистернах и вагонах-цистернах при проходе молока через (шланги) трубы с помощью насоса, помещенного в большое отверстие;

- с помощью сжатого воздуха, чистого и фильтрованного: используется минимальное количество воздуха и давления во избежание изменения вкуса молока.

4.3. Автоматический и полуавтоматический отбор проб.

Для автоматического или полуавтоматического отбора проб сырого молока от производителя используется инвентарь для отбора согласно лабораторным инструкциям или другим компетентным данным.

До использования инвентарь поверяется первично, а потом регулярно соответствующими поверочными органами.

Пробы, отборный процесс и техника отбора контролируются, чтобы установить:

- минимальное количество молока для отбора пробы;

- пропорцию манипуляции, связанной с отбором минимального количества;

- способность передачи представленной пробы из общего количества молока после качественного перемешивания.

Для использования автоматического или полуавтоматического инвентаря пробы отборника компетентные национальные органы должны установить следующее:

- минимальное количество молока, из которого отбирается проба;

- минимальное количество проб;

- максимальные вовлеченные количества;

- какие проводить исследования, предварительные действия.

4.4. Пробы молока, термически обработанного, для непосредственного использования в розничной торговле отбираются в цельной, закрытой посуде.

Пробы отбираются по мере возможности из мест хранения и холодильников перерабатывающего предприятия, сразу или в день переработки (для пастеризованного молока - в день пастеризации).

Лучше всего отбирать столько проб, сколько типов молока было обработано пастеризацией и стерилизацией, соответственно и число проб, подвергнутых исследованиям согласно индикациям исследовательских лабораторий, а также компетентной власти.

5. Идентификация пробы

Проба должна иметь идентификационный код для быстрой идентификации согласно индикации лабораторий или компетентных органов.

6. Транспортировка и хранение проб

Компетентными органами разрабатываются инструкции по транспортировке и хранению, а также срокам отбора и проведения анализа в зависимости от типа молока и процедуры исследований:

a) предварительные меры во время транспортировки и хранения пробы для предохранения от прямых солнечных лучей и от нежелательных запахов (если емкость с пробой прозрачная, то изолируется от света);

b) пробы сырого молока для микробиологического анализа транспортируются и консервируются при температуре 0⁰С и 4⁰С. Сроки отбора и проведения исследований должны быть минимальными, но не больше 36 ч. Компетентные власти могут допустить консервирование между 0⁰С и 6⁰С, если срок не превышает 24 часов;

c) пробы пастеризованного молока для микробиологических исследований транспортируются и хранятся при 0-4⁰С. Сроки между отбором и проведением исследований не должны превышать 24 часов;

d) другие пробы молока (не сырого и пастеризованного) для микробиологических исследований хранятся в холодильниках лаборатории, и сроки от отбора до проведения исследований должны быть минимальными. Предварительные меры для некоторых исследований описаны в используемых методиках.

Приложение 2

к ветеринарно-санитарным правилам

в отношении некоторых методов анализа

сырого и термически обработанного

молока

РАЗДЕЛ 1

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТОЧКИ ЗАМЕРЗАНИЯ МОЛОКА

1. Метод и область применения

Настоящий раздел устанавливает метод определения точки замерзания цельного молока, частично обезжиренного, сырого, пастеризованного, термически обработанного ультравысокой температурой или стерилизованного.

Для определения точки замерзания используется аппарат - термистор (криоскоп и термометр с полупроводниковым сопротивлением), где водяная баня, термостат охлаждается через электроразмораживание, и термистор заменяет термометр ртутный.

Существует два вида инструментов. Первый проверяет максимальную точку замерзания на фоне кривой замерзания, второй является коммерческим, отрегулированным так, чтобы можно было в любой момент прочитать данные после начала замораживания.

Зная о том, что кривые замерзания могут варьировать не только от молока к молоку, а также между молоком и стандартными растворами, используемыми для эталонирования, этот процесс требует использования инструментов для исследования площадки. Инструменты с чтением на точных интервалах могут использоваться при исследованиях молока.

Точка замерзания может быть использована для определения пропорций воды в молоке, если кислотность пробы не превышает 0,18 г молочной кислоты на 100 мл.

2. Определение

Точка замерзания молока: измерение значения по вышеизложенному методу, данному ветеринарно-санитарному нормативу, в градусах ^oС.

3. Принцип

Охлаждение пробы до 0^oС соответственно аппарату и началу кристаллизации через механическую вибрацию быстрого повышения температуры до точки, соответствующей точке замерзания. Инструмент разработан таким образом, чтобы можно было прочитать данные при использовании 2 стандартных растворов, используя тот же метод работы, как и для проб молока. В таких условиях показывается точка замерзания молока в градусах ^oС.

4. Аппаратура, материалы, реактивы

4.1. Криоскоп

Криоскоп состоит из водяной бани-термостата; термо-метра метастатического типа; гальванометра; мешалки для пробирки с пробой, сосуда первичного охлаждения и пробирки для пробы, щупа-термистора.

4.1.1. Баня для охлаждения, используемая для определения точки замерзания молока существует двух типов:

a) иммерсионный тип - это изолированный сосуд, наполненный охлаждающей смесью, поддерживающей температуру и не отклоняющийся на 0,2^oС. Температура не должна варьировать более 0,5^oС от установленной изготовителем. Вся площадь пробирки с пробой должна быть покрыта охлаждающей смесью;

b) тип с циркуляцией смеси, когда смесь все время циркулирует в бане вокруг пробирки с пробой. Температура смеси не должна варьировать более 0,5^oС от установленной изготовителем. Охлаждающая смесь, состоящая из 1,2-етандиола с водой (этиленгликоль) 33%-ная, является подходящей соответствующей смесью.

4.1.2. Термистор и взаимосвязанная цепь.

Термистор - это стеклянный щуп диаметром 1,8 ±0,2 мм и диаметром проводника 0,31 мм. Константа времени (постоянная величина) термистора должна быть менее двух секунд и ее величина "V" должна быть высокой. Рабочее напряжение, энергия и рассеивающая константа должны быть такими, чтобы температура термистора не превышала 0,0005^oС в пределах 0,512^oС. Допустимое отклонение ±15%.

Когда щуп находится в рабочем положении в криоскопе, стеклянная конечность должна быть в пробирке с пробой и на 44,6±0,1 мм под пробиркой. Необходимо использовать аппарат для центрирования этого щупа в таком положении.

Примечание: "V" - определяет термические характеристики термистора по формуле:

dR x I V
dT R, = T²

где Т - температура в градусах Кельвина,

R - сопротивление в Ом к Т

dR x I
dT R, - коэффициент температуры,

"V" - константа, которая зависит от материала, из которого сделан термистор. На практике рекомендуется величина более чем 3000.

4.1.3. Аппарат для измерения и чтения

4.1.3.1. Принцип измерения

Используемый инструмент должен работать по принципу исследования первой "ступени" по кривой точки замерзания. Первая ступень соответствует той части кривой, где температура остается постоянной при 0,002^oС не менее 20 сек.

4.1.3.2. Ручной метод

Сопротивление термистора должно быть отрегулировано, используя постоянные сопротивления высшего качества с толерантностью ±10%, где температурный коэффициент не превышает 2 x 01%10^{-5 0}С.

Эталонное сопротивление должно быть однолинейным в своем использовании 0,3% - более чем максимальная величина.

Эталонные сопротивления должны быть откалиброваны. Расстояние между метками столбика измерения не должно быть более 0,001^oС.

4.1.3.3. Автоматический метод

Аппарат измерения должен читать менее чем 0,001oС в интервале 0-1oС. Стабильность аппарата не должна иметь отклонения более 0,001^oС между двумя измерениями одной и той же температуры.

4.1.4. Мешалка

Для размешивания пробы используется металлическая трубка диаметром 1,5 мм.

Мешалка должна быть отрегулирована и установлена вертикально, а внутренний конец должен быть на одном уровне с верхушкой щупа термистора.

Разрешается изменение положения на ±1,5 мм.

Мешалка должна вибрировать латерально со скоростью, предложенной производителем, чтобы обеспечить постоянную температуру пробы во время исследования. Во время работы мешалка не должна дотрагиваться до щупа термистора или стенок пробирки.

4.1.5. Аппарат по замораживанию. Этот аппарат при включении должен обеспечить начало замораживания пробы так, чтобы температура пробы была в области точки замерзания. Можно использовать мешалку если повысить вибрацию в течение 1-2 сек.

4.1.6. Пробирки для проб

Пробирки, используемые для проб, должны быть стеклянными высотой 50,8 ± 0,1 мм, внешним диаметром 16,0 ± 0,1 мм и внутренним 13,5 ± 0,1 мм. Толщина стекла не должна быть более 0,1 мм.

Пробирки должны иметь метки на 29,8 мм от горла, чтобы показать количество пробы 2,5 ± 0,1 мл.

4.1.7. Электропитание

Напряжение электрического тока должно быть постоянным как при входе, так и в самом аппарате таким образом, чтобы колебания не превышали ±1% от номинального значения, когда колебания тока в главном источнике питания составляет 6%.

4.2. Весы аналитические

4.3. Колбы мерные 1000 мл, класса А.

4.4. Сушильный шкаф с вентилятором на 130±1oС или муфельная печь на 300±25oС

4.5. Эксикатор

5. Реактивы

5.1. Дистиллированная вода, кипяченая и охлажденная до 20oС ±2oС

5.2. Хлористый натрий, высушенный в течение 5 часов при 300 ± 25oС в муфельной печи или при температуре 130 ± 1^oС 24 часа в сушильном шкафу и охлажденный до комнатной температуры в эксикаторе.

5.3. Градуировочные растворы

Взвешивается точное количество хлористого натрия (высушенного) по таблице:

GNaCl/l	^oC
6,859 7,818 8,149 8,314 8,480 8,646 8,811 8,977 9,143 10,155	-0,408 -0,464 -0,483 -0,492 -0,502 -0,512 -0,521 -0,531 -0,541 -0,600

Точка замерзания раствора хлористого натрия при 20⁰С.

Растворяют в дистиллированной воде, вносят в мерную колбу на 1000 мл и объем доводят до метки дистиллированной водой при 20\xf120С. Этот ратвор консервируется в течение 2 месяцев при 5⁰С в п/э флаконе, герметично закрытом 250 мл.

Перед применением градуировочный раствор перемешивают осторожным перевертыванием и вращением бутылки. Порцию градуировочного раствора вливают прямо в пробирку. Не используется пипетка. Нельзя использовать растворы из флаконов на з/и пустые и хранения более 2 месяцев

6. Калибровка криоскопа и термистора

Криоскоп должен быть откалиброван так, чтобы температура не отклонялась более чем на 1⁰С от эталонной температуры. Криоскоп не должен быть под прямыми солнечными лучами, на сквозняках, при температуре более 26-27⁰С. Перед калибровкой криоскопа надо убедиться, что он был прогрет в течение 12 часов и его состояние соответствует требованиям производителя. Уточняется положение датчика частоты вибрации смесителя и температура охладителя.

Для калибровки используют 2 раствора, градуированных по таблице, ближе к точке замерзания молока. Разность между точками замерзания градуировочного раствора не должна превышать - 0,100oС (некоторые типы криоскопов имеют в своих измерительных шкалах те точки, которые нам нужны, и калибровка происходит легче).

Вносится пипеткой 2,5 ± 0,1 мл градуировочного раствора в чистую, сухую пробирку и проводятся измерения.

Примечание: пробирки, использованные для калибровки прибора, должны быть идентичными для проб молока: из того же стекла, обработанные так же. Температура градуированных растворов должна быть идентична пробам молока.

Проводится калибровка криоскопа с использованием сначала первого раствора, потом второго раствора последовательно несколько раз, альтернативно, пока на криоскопе будут одни и те же значения без лишних аппарата.

7. Подготовка пробы молока

7.1. Если есть необходимость, проба консервируется при 0-5^oС.

7.2. Проба очищается от всех видимых примесей или жира, фильтрацией и медленным перемешиванием.

7.3. Молоко может быть исследовано при температуре консервации 0-5⁰С или доведено до комнатной температуры. Растворы будут той же температуры что и молоко.

7.4. Анализ на кислотность молока должен проводиться перед исследованием точки замерзания. Пробы с кислотностью выше 0,18 г молочной кислоты на 100 мл пробы не используются.

7.5. Молоко, стерилизованное и кипяченое, при ультравысокой температуре перед исследованием должно находиться в открытом сосуде 20 мин.

8. Проведение анализа

8.1. Первичная проверка.

Проверяется, если уровень и температура охлаждающей смеси соответствуют назначениям производителя и щуп термистора находится в пробирке для исследования пустым. Вводят в работу криоскоп, убеждаются, что охлажденная смесь перемещается соответственно. Если криоскоп работает 12 часов беспрерывно, проверяется все заново.

8.2. Проверки при калибровке

Перед каждой серией проб измеряется точка замерзания одного градуированного раствора натрия хлористого (например, точка замерзания 0,512⁰С) до тех пор, пока разность между двумя измерениями подряд не будет 0,001^oС. Если среднее арифметическое 2 измерений расходится более чем 0,002⁰С, то криоскоп снова градуируется (калибруется) как в п. 6. Если криоскоп работает (используется) все время, то он калибруется через каждый час.

8.3. Определение точки замерзания молока

Осторожно перемешивается содержимое сосуда с молоком.

Вносится пипеткой 2,5 ± 0,1 мл молока в чистую сухую пробирку. Вставляется в криоскоп. Молоко охлаждается и начинается замерзание около 0,1⁰С от температуры, определенной изготовителем.

Если замерзание молока началось до или после определенной температуры, прекращают измерение и начинают другую пробу. Если то же происходит и со второй пробой, берут пробу молока и греют до 45⁰С и выдерживают 5 мин при этой температуре, чтобы растопить жир. Опять охлаждают и исследуют. Температура молока после начала замерзания растет быстро до определенной точки, одно время остается неизменной, потом снижается. Точка замерзания соответствует точке, когда температура не изменяется перед снижением.

Примечание: время, когда температура находится на высшей точке и интервал времени от начала замерзания до самой высокой точки температуры изменяется от пробы к пробе, и является меньше для воды и градуированных растворов.

После окончания измерения пробирка с пробой вынимается и промывается, термистор и мешалка обтираются чистой мягкой тряпкой. Это проводится после каждого второго определения.

8.4. Охлаждение пробы

После использования в аппарат вставляется пустая пробирка для того, чтобы держать щуп в холоде (с некоторыми типами криоскопов этого невозможно проделать).

9. Обработка результатов

9.1. Результат анализа

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов 2 параллельных определений, округленное до третьего знака после запятой.

Если сумма 2 определений непарная, берется до2-го знака после запятой.

Пример.

Два определения

Среднее

0,544-0,545>0,544

0,545-0,546>0,546

9.2

9.2.1. Повторяемость (ч)>0,004 ⁰С

9.2.2. Воспроизводимость (R)>0,006 ⁰С

РАЗДЕЛ 2

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОСФAТAЗНОЙ АКТИВНОСТИ

1. Предмет и область применения

2. Настоящая глава описывает метод определения фосфотазной активности в пастеризованном молоке.

3. Определение:

3.1. Фосфатазная активность состоит в измерении щелочной фосфатазной активности в продукте: это выражается в количестве фенола в мг/мл молока.

3.2. Фосфатазная активность молока считается отрицательной, если меньше 4 мг фенол/мл.

4. Принцип

Фосфотаза из пробы молока выделяет фенол при добавлении динатрия фенилфосфата. Выделяемый фенол реагирует с дибромхикон-хлоримид образца дибром - индофенол (синего цвета), которая измеряется при длине волны 610 нм по отношению к холостой пробе (проба, в которой отсутствуют энзимы).

4. Реактивы

4.1. Буфер борат-гидроксид бария.

4.1.1. 50 г гидроксид бария (Ba (OH)₂ - 8H₂O) растворяют в воде и доводят до 1000 мл

4.1.2. 22 г борной кислоты (Н3ВО₂) растворяют в воде и доводят до 1000 мл.

4.1.3. Нагревают по 500 мл каждого раствора до 50oС, перемешивают, быстро охлаждают до 20^oС, доводят рН раствора на 10,6 ± 0,1 при помощи растворов 4.1.1 или 4.1.2 и фильтруют.

Раствор хранят в хорошо закрытой посуде.

4.1.4. Перед употреблением раствор разводят водой 1:1.

4.2. Буфер, обеспечивающий цвет 6,0 г метабората натрия ( NaBO₂) или 12,6 NaBO3 4Н2О и 20,0 хлористого натрия (NaCL) растворяют в воде и доводят до 1000.

4.2. Буфер, обеспечивающий цвет, разбавленный 10 мл буфера для цвета (4.2), разводят водой до 100 мл.

4.4. Основа буфера: 0,1 г динатрия фенилфосфата обезвоженного свободного от фенола растворяют в 100 мл буфера (4.1.3) или растворяют 0,5 г денатурата фенилфосфата в 4,5 мл буфера, обеспечивающего цвет, добавляют 2 капли ВQС (4,6) и оставляют при комнатной температуре 30 мин. Экстрагируют цвет с 2,5 мл бутанола-1 и оставляют до разделения бутанола. Декантируют бутанол и отделяют. При необходимости операцию повторяют. Раствор можно хранить несколько дней в холодильнике для развития интенсивности цвета с последующей экстракцией перед употреблением.

Готовят буферную основу перед употреблением, растворяя 1 мл этого раствора в 100 мл буфера борат-гидроксит бария (4.1.3)

4.5. 3 г сульфата цинка (ZnSO4 7H2O) и 0,6 г сульфата меди (CuSO4 5 H2O) растворяют в воде и доводят до 100 мл.

4.6. Раствор дибром-2,6 хинонклоринид (раств. ВО2С) 40 мг ± 1дибром-2,6 хинонклоринид (С6Н2В2СLNO6) растворяют в 10 мл этилового спирта 96% (V/V). Хранят в холодильнике в темной посуде в течение одного месяца. Если меняется цвет раствора, он уже не годен.

4.7. Раствор сульфата меди 0,05 г сульфата меди (CuSO4 5 H2O) растворяют в воде и доводят до 100 мл.

4.8. Стандартный раствор фенола

4.8.1. Взвешивают 200 мг 2 мг безводного химически чистого фенола, количественно переводят в мерной колбе на 100 мл, растворяют в воде, перемешивают и доводят до 100 мл. Раствор хранят в холодильнике несколько месяцев.

4.8.2 Разбавляют 10 мл концентрированного раствора водой до 100 мл. 1 мл раствора содержит 200 мг фенола.

5. Аппаратура и посуда

Примечание:

а) вся посуда, пробки, инструменты хорошо промывают и ополаскивают свежей кипяченой водой.

b) нельзя использовать пробки, которые могут выделить фенол.

Обычные лабораторные материалы:

5.1. Аналитические весы.

5.2. Водяная баня, терморегулируемая на 37 ± 1oС.

5.3. Спектрофотометр, который позволяет анализировать раствор при длине волны 610 nm.

5.4. Пробирки 16 или 18 мм х 50 мм желательно градуированные на 5 и 10 мл

5.5. Пипетки

5.6. Стеклянные воронки нужных диаметров, например с диаметром 5 см.

5.7. Гофрированные фильтры с диаметром 9 см со средней скоростью фильтрования.

5.8. Мерные колбы для приготовления стандартных растворов.

6. Ход работы

Примечание:

а) избегать попадания прямого света во время определений;

b) отрицательное влияние могут иметь следы слюны и пота на ход анализа. Соответственно надо соблюдать меры предосторожности при работе с пипетками.

6.1. Подготовка пробы

6.1.1. Анализ проводится сразу после отбора пробы. При необходимости проба хранится в холодильнике 2 дня.

6.2. Отбор пробы.

В двух пробирках (5.4) отбирают по 1 мл пробы, одна из которых - контрольная проба.

6.3. Определение.

6.3.1. Нагревают контрольную пробу в течение 2 минут в горячей воде, пробирку и сосуд с горячей водой накрывают алюминиевой фольгой. Охлаждают быстро до комнатной температуры.

6.3.2. В дальнейшем проводят одинаковые операции в обеих пробирках. Добавляют 10 мл буферной основы (4.4) и гомогенизируют.

6.3.3. Пробирки сразу инкубируют на водяной бане (5.2) в течение 60 мин, изредка перемешивая (не менее 4 раз).

6.3.4. Нагревают в горячей воде в течение 2 мин. при тех же условиях как в 6.3.1. Охлаждают быстро до комнатной температуры.

6.3.5. Добавляют по 1 мл раствора Cu Zn (4.5) в каждую пробирку и осторожно перемешивают.

6.3.6. Фильтруют через сухой бумажный фильтр, выливая первые 2 мл, повторно фильтруют до получения полностью прозрачного фильтрата и отбирают 5 мл фильтрата в пробирку.

6.3.7. Добавляют 5 мл буфера для развития цвета (4.2).

6.3.8. Добавляют 0,1 мл раствора BQC (4,6), перемешивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре для проявления цвета.

6.3.9. Измеряют оптическую плотность по отношению к контрольному раствору при длине волны 610 мм.

6.3.10. Если оптическая плотность от 6.3.9 превышает оптимальную плотность стандартного раствора, который содержит 20 мг фенола, измеренная соответственно (6.4.4), повторяют определения с разбавленной пробой.

6.4. Построение градуированного графика

6.4.1. Из стандартного раствора фенола (4.8.2) готовят серию стандартных растворов, содержание: 0 (контрольная проба), 2,5 : 10,0 и 20,0 мг фенол/мл. В 5 пробирок добавляют по 1 мл воды и по 1 мл каждого стандартного раствора.

6.4.2. В каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора сулфата меди (4,7), 5 мл буфера, обеспечивающего цвет, разбавленного (4.3) 3 мл воды и 0,1 мл раствора BGC (4.6), гомогенизируют (перемешивают).

6.4.3. Оставляют при комнатной температуре на 30 мин для развития цвета.

6.4.4. Измеряют оптическую плотность в соотношении с контрольной пробой при 610 мм (5.3).

6.4.5. По полученным данным методом наименьших квадратов вычисляют зависимость оптической плотности от массовой доли фенола.

7. Обработка результатов

7.1. Рецепт и формула

7.1.1. С помощью измерений оптической плотности (6.3.9) и уравнения регрессии рассчитывают количество фенола (6.4.5).

7.1.2. Рассчитывают фосфатазную активность, выраженную в мг/фенол/мл пастеризованного молока по формуле: фосфатазная активность = 2,4 х А х Д, где

А - количество фенола в мг, полученное по п. 7.1.1,

Д - фактор растворимости (6.3.10) (если нет разбавления, Д = 1),

2,4 - фактор растворимости (5/12 из 1 мл пробы),

6,2 - в соответствии с пп. 6.3.2, 6.3.5, 6.3.6.

7.1. Точность

7.1.1. Воспроизводимость (ч) : 2 мг фенол/мл

7.1.2. Расхождение (R) : 3 мг фенол/мл

7.1.3. Если разбавление делается по (6.3.10), лимиты, указанные в пп. 7.2.1 и 7.2.2, относятся к результатам, полученным с разбавленными пробами.

РАЗДЕЛ 3

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРОКСИДНОЙ АКТИВНОСТИ

1. Предмет и область применения

Настоящая глава описывает метод определения пероксидазы в пастеризованном молоке.

2. Определение

Положительная реакция на тест пероксидазы: если молоко было пастеризовано неправильно, синяя окраска появляется в течение 30 сек после перемешивания.

Отрицательная реакция на пероксидазу:

В течение 30 сек после перемешивания окраска не меняется.

3. Принцип

Пероксидаза разлагает перекись волорода. Выделенние атомов кислорода превращает путем окисления парафенилендиамин бесцветный в индофенол пурпурный (тест Сторч). Интенсивность окраски пропорциональна концентрации энзимов.

4. Реактивы

4.1. Раствор 1.4 - парафенилендиамин 2 г 1,4 пара-фени-лендиамин (C6H8N2) растворяют в теплой воде (50⁰С) и доводят до 100 мл. Раствор хранят в темных склянках со специальными пробками в темном и прохладном месте. Через 1-2 дня раствор образует осадок, который отделяют.

4.2. Раствор перекиси водорода - 9 мл перекиси водорода 30%-ной разбавляют водой и доводят до 100 мл. Для устойчивости раствора добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты на 1 л раствора.

Раствор перекиси водорода устойчив в течение месяца при хранении в темном прохладном месте в хорошо закрытых склянках со стеклянными пробками и без органических примесей.

5. Ход работы

5.1. В чистую пробирку с крышкой отбирают 5 мл исследуемого молока.

5.2. Добавляют 5 мл раствора 1,4 парафини-лендиамина (4.1).

5.3. Добавляют 2 капли раствора перекиси водорода (4.2).

5.4. Наблюдают изменение цвета в первые секунды после перемешивания. Если появляется синяя окраска спустя 30 сек после добавления реактива, реакция не является специфичной.

РАЗДЕЛ 4

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО КОЛИЧЕСТВА
БАКТЕРИЙ МОЛОКА ПРИ 30⁰С

1. Область распространения

Настоящий раздел устанавливает определение общего количества бактерий при 30⁰С в сыром молоке, пастеризованном, кипяченом при ультравысокой температуре и стерилизованном.

2. Правило

"Микроорганизмы" - это все организмы, образующие колонии после инкубирования в аэробных условиях.

3. Принцип

Смешивают некоторое количество молока со средой в чашках Петри и инкубируют при 30⁰С 72 часа. Считают выросшие на чашке Петри колонии и рассчитывают количество микроорганизмов в 1 мл молока сырого, пастеризованного или в 0,1 мл - стерилизованного и кипяченого при ультравысокой температуре.

4. Аппаратура, материалы и реактивы

4.1. Аппаратура

4.1.1. Сушильный шкаф с температурой 170⁰С- 175⁰С

4.1.2. Автоклав 121⁰С ± 1⁰С

4.1.3. Термостат 30 ± 1⁰С

4.1.4. РН-метр

4.1.5. Водяная баня до 45 ± 1⁰С

4.1.6. Лупа 2-4-кратная

4.1.7. Лупа 8-10-кратная

4.1.8. Счетный аппарат с регистрацией

4.1.9. Мешалка с мощностью для перемешивания 1 мл молока с 9 мл раствора

4.2. Посуда стеклянная

4.2.1. Пробирки с пробками на 15-20 мл, чтобы можно было перемешать 10 мл раствора

4.2.2. Колбы на 150-250 мл или пробирки на 20 мл для сред

4.2.3. Пипетки на 1 мл с ватными пробками

4.2.4. Чашки Петри стеклянные и одноразовые с диаметрами 90-100 мм. Высота стенок 10 мм

4.2.5. Стерильность посуды

Посуду стерилизуют следующими способами:

a) в сушильном шкафу при температуре 170-175⁰С не менее 1 часа

b) в автоклаве при температуре 121 ± 1oС - 20 минут

5. Приготовление питательных сред

5.1. Состав: Дрожжевой экстракт - 2,5 г

Триптон 5,0 г

Д-глюкоза или декстроза 1,0 г

Сухое обезжиренное молоко 1,0 г

Агар-агар 10-15 г

Вода 1000 мл

Сухое обезжиренное молоко не должно содержать ингибирующих веществ, что проверяется адекватным методом.

Приготовление:

Размешивают в воде дрожжевой экстракт, потом глюкозу и в конце молоко, нагревают. Потом добавляют агар-агар и греют до кипячения, фильтруют.

Проверяют рН. Для поправки рН используют раствор NaOH 0,1 моль/мл, чтобы после стерилизации рН был 6,9 ± 0,1 при 25oС.

5.2. После фильтрования среду разливают во флаконы на 100-150 мл или по 12-15 мл в пробирки. Закрывают пробками. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 ± 1⁰С 15 минут. Проверяют рН. Хранится среда при температуре 1-5⁰С месяц.

5.3. Готовые сухие среды приготавливают по назначению производителя, но добавляют сухое молоко.

6. Реактивы

6.1. Пептоно-солевой раствор

Пептон - 1,0 г

NaCl - 8,5 г

Вода - 1000 мл.

Растворяют в воде, доводят рН, чтобы после стерилизации он составлял 7,0 ± 0,1 при температуре 25⁰С.

6.2. Раствор разливают в пробирки, чтобы после стерилизации было 9 ± 0,2 мл. Раствор стерилизуют в автоклаве при температуре 121 ± 1⁰С 15 минут. Проверяют рН. Хранят в холодном месте 1 месяц.

7. Проведение анализа

7.1. Перед проведением анализа растапливают нужное количество среды и охлаждают до 45 ± 1⁰С на водяной бане.

7.2. Подготовка пробы

Перемешивают пробу 25 раз, но без образования пены (3 минуты)

7.3. Приготовление разведения (10^-1) (молоко сырое и пастеризованное).

Переносят с помощью стерильной пипетки 1 мл пробы в 9 мл растворителя по п. 6.1, чтобы пипетка не контактировала с растворителем. Температура растворителя должна быть одинаковой с температурой пробы.

Перемешать хорошо 5-10 секунд. Получили разведение 10^-1.

7.4. Приготовление следующих разведений (молоко сырое пастеризованное).

Переносят стерильной пипеткой 1 мл из разведения 10^-1 в пробирку с 9 мл раствора как в п. 7.3. Получаем разведение 10^-2 и т. д.

7.5. Посев

7.5.1. Сырое молоко: из каждого разведения должно быть засеяно 1 мл в одну чашку Петри с заранее маркированной крышкой. Засевают два разведения пробы.

7.5.2. Пастеризованное молоко: так же как и с сырым молоком.

7.5.3. Молоко кипяченое при ультравысокой температуре и стерилизованное молоко (засевают после инкубации проб в течение 15 дней при 30oС). Засевают по 0,1 мл пробы из каждого разведения. 2 разведения, 2 чашки.

7.6. Разлив питательной среды.

Заливается по 15-18 мл среды в каждую чашку Петри. Сразу после заливки агара содержимое чашки Петри тщательно перемешивают путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала.

7.7. Выращивание

После застывания агара чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в термостат с температурой 30 ± 1oС на 72 часа.

7.8. Подсчет колоний

Подсчитывают колонии в тех чашках, где не более 300 колоний.

При большом числе колоний чашку делят на два сектора и считают тот сектор, где лучше всего можно считать, после чего рассчитывают всю чашку.

8. Обработка результатов

8.1.1. Берут результаты из чашек, где выросло от 10 до 300 колоний - не более

    8.1.2. Вычисляют количество микроорганизмов в 1 мл молока, пастеризованного или сырого по формуле:
    SC            SC
    ml     = (n₁+ 0,1 n₂d) , где

SC - количество колоний, подсчитанное на чашке Петри,

(n₁+0,1n₂)d - объем засеянной пробы, в котором:

n₁ - число чашек первого разведения,

n₂ - число чашек второго разведения,

d - коэффициент разведения.

Полученное число округляют до двух цифр. Если число, предназначенное для округления 5, округляют так, чтобы цифра слева была четной.

Пример (молоко пастеризованное):

Разведение 10^-2 : 278 и 290 колоний

Разведение 10^-3 : 33 и 28 колоний

    Количество        278+290+33+28    629
    мл                       =   (2+0,1x 2)10^-2= 0,022 =   28590 ≈ 29000 = 2,9 x 10⁴, где
    8.1.3. Если при счете получаем менее 10, то отмечаем, что количество микроорганизмов в 1 мл менее чем 10 x 01%d.

8.1.4. Если на чашках выросло более 300 колоний и можно считать, то поступают так: результат пишут как "количество микроорганизмов на мл".

8.2. Молоко кипяченое при ультравысокой температуре и стерилизованное.

Количество микроорганизмов более 10 колоний на 0,1 мл считать несоответствующим.

РАЗДЕЛ 5

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
В МОЛОКЕ ПОДСЧЕТОМ КОЛОНИЙ, ВЫРАЩЕННЫХ ПРИ 21^oС

1. Предмет и сфера применения

Настоящий раздел описывает методику подсчета микроорганизмов, выращенных при 21⁰С в инкубированном 5 дней при 6⁰С молоке, для определения способностей психрофильных микроорганизмов, развивающихся при 6⁰С в молоке.

2. Определение

Под "микроорганизмами" подразумеваются все организмы, способные развиваться и образовывать колонии после инкубации в анаэробных условиях.

3. Сущность метода

Инкубация пастеризованного молока 5 дней при 6⁰С. Посев определенного количества проинкубированного молока на чашки Петри с питательной средой, культивированные при 21⁰С 25 часов. Подсчет колоний и расчет количества микроорганизмов в 1 мл пастеризованного молока.

4. Аппаратура, посуда. Лабораторный материал

4.1. Аппаратура

4.1.1. Сушильный шкаф с терморегулятором на 170-175⁰С.

4.1.2. Автоклав с терморегулятором на 121 ± 1⁰С.

4.1.3. Термостаты с терморегуляторами на:

а) 6,0 ± 0,2⁰С;

b) 21 ± 1⁰С;

4.1.4. рН-метр с температурным корректором, чувствительный к 0,1 ед. рН.

4.1.5. Водяная баня с терморегулятором на 45 ± 1⁰С.

4.1.6. Увеличительное стекло 2-4-кратное.

4.1.7. Увеличительное стекло 8-10-кратное.

4.1.8. Счeтчик для подсчета колоний.

4.1.9. Мешалка, способная смешивать 1 мл пробы в десятикратном разведении с 9 мл физраствора.

4.2. Посуда

4.2.1. Пробирки с пробками для достижения десятикратных разведений.

4.2.2. Флаконы в объеме 150-250 мл или пробирки на 20 мл.

4.2.3. Пипетки стеклянные или из синтетического стерильного материала на 1 мл с диаметром 1,75-3 мм.

4.2.4. Чашки Петри стеклянные или из синтетического стерильного материала с внутренним диаметром 90-100 мм и глубиной 10 мм. Дно цельное, прозрачное.

4.2.5. Стерилизация посуды

а) в сушильном шкафу (4.1.1) при 170-175⁰С 1 час;

b) в автоклаве (4.1.2) при 121 ± 1⁰С 20 минут.

При автоклавировании должны учитываться все меры предосторожности при генерации пара. Если стерилизованный материал находится в емкости, эти емкости не закрываются герметически, пробки флаконов расслабляют. Посуду оставляют в автоклаве для подсыхания. Пипетки стерилизуются в сушильном шкафу.

5. Питательная среда для подсчета микроорганизмов в молоке на чашке Петри с агаром

5.1 Состав

Печеночный экстракт 2,5 г

Триптон 5,0 г

Глюкоза или декстроза 1,0 г

Обезжиренный молочный порошок 1,0 г

Агар-агар 10-15 г

Вода 1000 мл

Молочный порошок должен быть без ингибирующих веществ.

Приготовление

Все составляющие по порядку: печеночный экстракт, триптон, глюкоза, молочный порошок подогреть. Затем добавить агар-агар, кипятить, постепенно перемешивая, до полного растворения. Профильтровать. Измерить рН с помощью рН-метра (4.1.4). При необходимости рН доводят до уровня с помощью (0,1 моль/л) NaOH или HCl так, чтобы после стерилизации рН составлял 6,9 ± 0,1 при 25 ⁰С.

5.2 Стерилизация и консервация среды.

Среду (5.1) распределяют во флаконы по 100-150 мл или в пробирки по 12-15 мм (4.2.4). Ставят пробки и стерилизуют в автоклаве (4.1.2) при 121 ± 1⁰С 15 минут. Измеряют рН.

Если среда не используется сразу, хранить ее в темном месте при +1 +5^oС 1 месяц.

5.3 Сухая заводская среда.

Питательная среда (5.1) может быть приготовлена и из закупленных заводских сред по инструкции завода-изготовителя. Разбавить молочный порошок, если он не входит в состав.

Довести рН до 6,9 ± 0,1 при 25⁰С по п. 5.1, распределить, провести стерилизацию и консервирование по п. 5.2.

6. Растворители

6.1. Пептонный раствор / соль

Состав:

Пептон 1,0 г

NaCl 8,5 г

Вода 1000 мл

Приготовление
Составляющие растворяют в воде, подогревая. С помощью рН-метра (4.1.4) измеряют рН. При необходимости рН доводят до уровня при помощи (0,1 моль/л) NaOH или HCl так, чтобы после стерилизации рН составлял 7,0 ± 0,1 при 25oС.

6.2. Распределение, стерилизация, консервирование. Распределяют по пробиркам в таком объеме, чтобы после стерилизации рН составлял 9,0 ± 0,2 мл раствора. Ставят пробки. Стерилизуют в автоклаве (4.1.2) при 121 ± 1oС 15 мин. Измеряют рН, если раствор не используют сразу, хранят в темном месте при температуре 1-5^oС максимум месяц.

6.3. Сухие заводские растворители. Приготовление по (6.1) по инструкции фабриканта. Измеряют рН по 6.1, распределение, стерилизация, консервирование по 6.2.

7. Проведение анализа

7.1. Приготовление среды. Перед употреблением среду расплавляют и охлаждают до 45oС ± 1 на водяной бане (4.1.5).

7.2. Подготовка пробы

7.2.1. Инкубация пробы пастеризованного молока в непосредственной или обобщенной упаковке 100 мл в термостате (4.1.3а) при 6⁰ ± 0,5 ⁰С х 120 ± 2 г.

7.2.2. После инкубации для равномерного размещения микроорганизмов в пробе тщательно перемешивают, переворачивая емкость с пробой 25 раз, не допуская образования пены. Время от перемешивания до взятия определенного количества пробы не должно превышать 3 мин.

7.3. Приготовление первого разведения.

Стерильной пипеткой отбирают 1 мл пробы (7.2.2) и переносят в пробирку с растворителем - 9 мл (6.1), не касаясь поверхности раствора. Состав перемешивают осторожно с помощью мешалки (4.1.9) 5-10 сек. Таким образом получается первое разведение 10^-1.

7.4. Приготовление следующих десятикратных разведений.

Переносят стерильной пипеткой из первого разведения (7.3) в 9 мл раствора 6.1 по 7.3. Получаем разведение 10 ^-2.

Повторяют десятикратные разведения, таким образом добывая адекватное количество микроорганизмов (8.1).

7.5. Глубинный метод посева

Стерильной пипеткой (4.2.3) вносят 1 мл пробы соответственного разведения в чашки (4.2.4). Минимум из двух разведений, по 2 чашки параллельно (8.1).

7.6. Заливка среды

Заливают в каждую чашку по 15-18 мл среды (9.1). Среду немедленно равномерно перемешивают круговыми движениями для одинакового распределения микроорганизмов в среде. Заливку завершают не позже 15 мин от внесения разведения в чашку. Оставляют на застывание в горизонтальном положении.

7.7. Инкубация чашек Петри

После застывания среды чашки с посевами вверх дном помещают в термостат (4.1.3 в) при 21^oС+1 на 25 ч.

7.8. Подсчет колоний

Подсчет ведут на чашках с общим количеством колоний не больше 300. Подсчет ведут при дневном свете с увеличительным стеклом (4.1.6) и счетчиком для подсчета колоний (4.1.8). В случае очень мелких колоний для более верного подсчета применяют большое увеличительное стекло (4.1.7) для различия колоний с мелкими частями пробы. Колонии с ползущим ростом считают одной, если эта колония разрослась на четверть части чашки, считают колонии вне этой зоны роста и общее число колоний на всю чашку. Если колония разрослась на всю поверхность, чашку исключают из подсчета.

8. Обработка и вычисление результатов

8.1. Используют только результаты чашек с расчетом от 10-300 колоний (8.3 и 8.4)

    8.2. Количество микроорганизмов в 1 мл пастеризованного молока вычисляют по формуле:

    SC            SC
    ml     = (n₁+ 0,1 n₂d) , где
    SC - общее количество колоний, подсчитанное по 8.1,

(n₁+0,1n₂)d - объем засеянной пробы, в котором:

n₁ - число чашек первого разведения,

n₂ - число чашек второго разведения,

d - коэффициент разведения.

Полученное число округляют до двух цифр. Если число, предназначенное для округления до 5, то округляют так, чтобы цифра слева была четной.

Пример (молоко пастеризованное):

разведение 10^-2 : 278 и 290 колоний,

    разведение 10^-3 : 33 и 28 колоний:
       Количество        278+290+33+28    629
      мл                    =   (2+0,1x 2)10^-2= 0,022 =   28590 ≈ 29000 = 2,9 x 10⁴

8.3. Если при счете получаем менее 10, то отмечаем, что количество микроорганизмов в 1 мл менее 10 x 01%d.

8.4. Если на чашках выросло более 300 колоний и можно считать, то поступают так: результат пишут как "количество микроорганизмов на мл".

РАЗДЕЛ 6

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИЙ ГРУППЫ КИШЕЧНОЙ
ПАЛОЧКИ ПОДСЧЕТОМ ВЫРОСШИХ КОЛОНИЙ ПРИ 30^oС

1. Предмет и сфера применения

В этом разделе описан метод подсчета колоний колиформенных бактерий в пастеризованном молоке, выросших при 30^oС.

2. Определение

Колиформы - бактерии, ферментирующие лактозу с образованием газа и формирующие характерные или нехарактерные колонии при 30^oС.

3. Сущность метода

Определенное количество проб молока, посеянных на чашке Петри со средой, инкубируется при 30oС 24 часа.

Затем на чашках ведут подсчет характерных колоний, а за неимением таковых ведут идентификацию нехарактерных колоний методом ферментации лактозы. Затем вычисляют число колиформенных бактерий на миллилитр пастеризованного молока.

4. Аппаратура и посуда. Лабораторные материалы

4.1. Аппаратура

4.1.1. Шкаф сушильный с терморегулятором на 170-175⁰С.

4.1.2. Автоклав с терморегулятором на 121⁰С ± 1.

4.1.3. Термостат с терморегулятором на 30⁰С ± 1.

4.1.4. рН-метр с температурным корректором, чувствительный 0,1 ед. рН.

4.1.5. Водяная баня с терморегулятором на 45⁰С ± 1.

4.1.6. Петля платиновая или нить хромная.

4.2. Посуда

4.1.1. Пробирки для тестирования с пробкой с приблизительным объемом 20 мл для среды п. 5.2 и уленгутки определенных размеров, подходящие к этим пробиркам.

4.1.2. Флаконы на 150-250 мл для селективных твердых сред (5.1).

4.1.3. Пипетки стеклянные или синтетические стерильные с объемом 1-10 мл с отверстием 1,75-3 мм в диаметре.

4.1.4. Чашки Петри стеклянные или синтетические стерильные, бесцветные, прозрачные с диаметром внутреннего дна 90-100 мм, с внутренней высотой 10 мм. Дно должно быть цельным, чтобы не было помех при подсчете колоний.

4.1.5. Стерилизация посуды

Стерилизация должна быть выполнена следующими методами:

а) в сушильном шкафу (4.1.1) при температуре 170-175⁰С в течение 1 часа;

b) в автоклаве (4.1.2) при температуре 121 ± 1⁰С 20 минут.

При работе с автоклавом должны соблюдаться все меры предосторожности. Если стерилизующийся материал находится в емкости, эти емкости не закрываются герметически, пробки флаконов расслабить. Посуда остается в автоклаве для подсыхания. Пипетки стерилизуются в сушильном шкафу.

5. Среды

5.1. Агар с лактозой и кристалл фиолетовый с нейтральным красным (КФАЛ). Твердая селективная среда

Состав:

Пептон 7 г

Печеночный экстракт 3 г

Лактоза (C₁₂H₂₂O₁₁H₂O) 10 г

Соль (NaCl) 5г

Жельные соли 1,5 г

Нейтральный красный 0,03 г

Кристалл фиолетовый 0,002 г

Агар-агар 10-15 г (в зависимости от уровня застывания)

Вода 1000 мл

Приготовление:

Все составляющие растворяются в воде, отстаиваются несколько минут. Тщательно перемешиваются.

Измеряется рН при помощи рН-метра (4.1.4). При необходимости рН доводится до уровня при помощи

(0,1 моль/л) NaOH или HCl так, чтобы после кипения рН составлял 7,4 ± 0,1 при 25⁰С. Весь состав ставят кипятить, изредка перемешивая, и сразу после кипения распределяют по флаконам в количестве 100-150 мл (4.2.2). Среду охлаждают при 45 ± 1⁰С на водяной бане (4.1.5). Проверяют стерильность среды при применении. Среду используют в последующие 3 часа после приготовления.

5.2 Бульон лактозный с бриллиантовой зеленью

Среда подтверждения

Пептон 10 г

Лактоза (C₁₂H₂₂O₁₁H₂O) 10 г

Сухая желчь 20 г

Бриллиантовая зелень 0,0133 г

Вода 1000 мл

Приготовление:

Составляющие растворяют в воде. Раствор доводят до кипения. С помощью рН-метра измеряют рН (4.1.4), при необходимости рН доводится до уровня при помощи (0,1 моль/л) NaOH или HCl так, чтобы после кипения рН составлял 7,2 ± 0,1 при 25⁰С. Среду распределяют по 10 мл в пробирки тестирования (4.2.1) с уленгутками (4.2.1), ставят пробки.

Стерилизуют в автоклаве (4.1.2) при 121 ± 1⁰С до уровня при помощи (0,1 моль/л) NaOH или HCl так, чтобы после кипения рН составлял 7,4 ± 0,1 при 25⁰С, 15 минут.

Уленгутка не должна пропускать воздух после стерилизации. Проверяется рН среды. Если среда не используется сразу, хранить ее в защищенном от света месте при 0-5⁰С месяц.

5.3. Заводские среды, сухие. Среды (5.1, 5.2) можно приготовить из сухих заводских сред по инструкции завода-изготовителя. Доводят рН, среду распределяют и стерилизуют по методике 5.1 и 5.2.

6. Проведение анализа

6.1. Среда

Используют среду (КФАЛ) по п.5.1.

6.2. Подготовка пробы молока

Пробу тщательно перемешивают для одинакового распределения микроорганизмов, сосуд с пробой переворачивают 25 раз без образования пены. Время перемешивания и отбора тестируемого материала не должно превышать 3 минут.

6.3. Посев на чашках Петри

В каждой из 3 чашек (4.2.4) делают посев по 1 мл пробы молока (6.2) с помощью стерильной пипетки (4.2.3), таким образом засевают 3 мл пробы.

6.4. Залив среды

Заливают среду (КФАЛ) (6.1) в каждую чашку по 12 мл. Сразу после заливки среды содержимое чашки следует тщательно перемешать путем легкого вращательного покачивания для равномерного распределения посевного материала.

Время от посева исследуемого материала до заливки среды не должно превышать 15 минут.

Для проверки стерильности готовят контрольные чашки с агаром КФАЛ, используемым для посева.

Сверху засеянной и застывшей среды заливают 4 мл агара (КФАЛ) (6.1) и оставляют для застывания.

6.5. Инкубация чашек

Инкубацию проводят в термостате (4.1.3). Чашки Петри переворачивают крышками вниз, не больше 6 в столбике, не касаясь друг друга и стенок термостата, при температуре 30 ± 1⁰С 24 ± 2 часа.

6.6. Подсчет колоний

Подсчитывают колонии в чашках, где не больше 150 колоний. Подсчитывают колонии темнокрасного цвета с осадком вокруг или без, что характерно для колиформенных бактерий размером не менее 0,5 мм.

6.6.1. Если несколько или все колонии имеют нехарактерный для колиформ цвет, форму и принцип роста, прибегают к подтверждающей пробе (6.7).

6.7. Подтверждающая проба

По п. 6.6.2 ставят подтверждающую пробу из 3-5 нехарактерных колоний посевом на бульоне с лактозой по п. 5.2 с помощью бакпетли (4.1.6). Посевы инкубируют при температуре 30 ± 1⁰С 24 ± 2 часа. Положительными считают посевы с помутненной средой и образованием газа в уленгутке.

7. Расчет и обработка результатов

7.1. Для подсчета (п. 7.4) оставляют чашки максимум со 150 колониями.

7.2. Если использовалась проба подтверждения, считается согласно проценту подтвержденных колоний.

7.3. Расчет количества колиформ в 1 мл пастеризованного молока ведут по формуле:

SC SC
мл = (n₁+ 0,1 n₂d) , где

SC - общее число колоний (7.1; 7.3), определенных в 3 мл молока.

Результат округляют до двух цифр, если больше 100 колоний. Если округленная цифра 5, то округляется влево до четной цифры.

Если все вычисления больше 150 колоний, результат записывают как "количество определенных колиформ в 1 мл):

(n₁+0,1n₂)d - объем материала, где:

n₁ - количество чашек в первом разведении;

n₂ - количество чашек во втором разведении;

d - степень разведения, с которого ведут учет.

РАЗДЕЛ 7

МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА
СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК В СЫРОМ МОЛОКЕ

1. Предмет и область применения

Настоящий раздел описывает процедуру определения реального количества соматических клеток в молоке микроскопическим методом. Этот метод устанавливает в том числе точность вычисления в флуороопто-спектрометрическом методе.

2. Определение

Под названием "соматические клетки" подразумевают клетки - лейкоциты, эпителиальные клетки, ядро которых закрашивается метиленовым синим.

3. Сущность метода

На предметное стекло наносят 0,01 мл молока. Капля подсушивается и окрашивается. Подсчет проводят под микроскопом. Число соматических клеток, вычисленных на определенной площади стекла, умножают на фактор мультипликации для определения числа клеток в 1 мл пробы.

4. Реактивы

Химические вещества должны быть качественными

Краситель

Состав:

Метиленовая синь 0,6 г

Этанол 99% 54,6 мл

1,1,1 - трихлорэтилен или тетрахлорэтан 40,6 мл

Уксусная кислота, ледяная 6,6 мл

Осторожно!

Тетрахлорэтан токсичен, работать под вытяжным шкафом!

Приготовление

Этанол перемешивают с 1,1,1 - трихлорэтиленом и подогревают на водяной бане при 60-70 ⁰С. Добавляют метиленовую синь и смесь охлаждают до 4⁰С 12-24 часа, затем добавляют уксусную кислоту. Фильтрует при помощи фильтра с 10-12-микронными порами. Хранят состав в плотно закрытых флаконах. При появлении осадка перед употреблением фильтруют.

5. Аппаратура, посуда

5.1. Микроскоп с увеличением от 500 до 1000.

5.2. Микропипетки, позволяющие брать объем в 0,01 мл с погрешностью 2%.

5.3. Стандартные предметные стекла 20мм x 01%5мм или с гравированным прямоугольником.

5.4. Горизонтальная пластина с подогревом (30-50⁰С) для подсушки стекол.

5.5. Вентилятор (типа фена).

5.6. Водяная баня для подогрева пробы молока с режимом 30-40⁰С.

5.7. Микрометр объектива с делением 0,01 мм.

6. Проведение анализа

6.1. Проба молока.

Пробу исследуют в первые 6 часов с момента отбора. Хранить при 6⁰С, не допуская замораживания.

6.2. Подготовка пробы в лаборатории. Подогревают на водяной бане (5.6) при 30-40⁰С и осторожно перемешивают. Охлаждают до 20⁰С.

6.3. Подготовка стекол. Отмывают стекла (5.3) этанолом, протирают фильтровальной бумагой, фломбируют и остужают. Хранят отдельно в чистом, защищенном от пыли месте.

6.4. Подготовка мазка

Микропипеткой (5.2) на поверхность стекла наносят 0,01 мл молока. Конец пипетки, который был в контакте с молоком, осторожно вытирают. После нанесения осторожно зажимают покровным стеклом и высушивают на горизонтальной пластине (5.4). От каждой пробы готовится минимум 2 мазка.

6.5. Окраска

Опускают на 10 минут в краситель (4). Подсушивают с помощью вентилятора (5.5). Мазки опускают в воду для удаления лишнего красителя, подсушивают и хранят отдельно.

6.6. Просмотр мазков

Подбирают увеличение (500-1000) с помощью микрометра (5.7) диаметр микроскопического поля.

7. Подсчет и расчет

7.1. Подсчет клеток.

С помощью микроскопа (5.1) вместо клеток считают ядра, попавшие в поле зрения. Считают клетки с центральных полей, не беря в расчет периферические зоны. Подсчет должен быть осуществлен таким образом, чтобы в число входили в одинаковом значении все поля зрения.

7.2. Определение минимального количества клеток

Так как микроскопический метод определения числа клеток может быть как методом проверки качественного определения числа механически или автоматически, то число не должно варьировать в большую сторону при электронном подсчете. Коэффициент вариации в пробе молока с 400000-600000 клеток в 1 мл не должен превышать 5%. По закону распределения Пуассона для достижения повторяемости числа количество соматических клеток не должно быть меньше 400.

Закон Пуассона определяется формулой:

М=V=S‘

где: М - среднее арифметическое значение,

V - вариация,

S‘- тип отклонения,

Коэффициент вариации

CV = S x 100 % или CV = 100 % или CV = 100 % ,

M S M
где: М - среднее количество увиденных клеток.

Пример: 400 для CV=5%.

7.3. Расчет фактора мультипликации

Используя 0,01 мл молока, фактор мультипликации определяют по п. 7.3.1.

7.3.1. Подсчет с границ поля

Длина границы подсчета 5 мм, значит, такова и ширина поля зрения. Ширина границы одинакова с диаметром микроскопического поля, определенным микрометром объектива (5.7).

    Фактор мультипликации:
    WF = 20 x 100
                 d x b

где: d - диаметр в мм микроскопического поля, определенный при помощи микрометра объектива (5.7),

b - количество подсчитанных границ.

7.4. Расчет количества клеток

Число соматических клеток (7.1 и 7.2) умножают на фактор мультипликации (7.3) для достижения количества клеток на 1 мл молока.

7.5. Точность

РАЗДЕЛ 8

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИБИОТИКОВ И СУЛЬФАНИЛАМИДНЫХ
ПРЕПАРАТОВ В СЫРОМ И ТЕРМИЧЕСКИ ОБРАБОТАННОМ МОЛОКЕ

1. Область распространения

Настоящий раздел описывает метод выявления антибиотиков и сульфаниламидных препаратов в сыром и термически обработанном молоке.

Метод предполагает:

А. Качественный метод

Этот анализ позволяет выявить содержание антибиотиков и сульфаниламидных препаратов и основан на использовании тест-культуры Bacilus stearothermophilus, разновидность - calidolactis, ATCS 10149. Этот метод является показательным для методов обнаружения.

В. Метод подтверждения и идентификации пенициллина

Этот метод используется для подтверждения результатов качественного анализа по идентификации пенициллина и определения концентрации.

А. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ МЕТОД

1. Область распространения

Этот метод описывает технику выделения антибиотиков и сульфаниламидных препаратов в сыром и термически обработанном молоке в концентрациях, превосходящих пределы, указанные в таблице¹⁾ 1

Название антибиотика	Предел определения
Название антибиотика	Отрицательный	Положительный
Benzilpenicilina	0,002	0,006
Ampicilina	0,002	0,005
Cloxacilina	0,015	0,035
Nafcilina	0,006	0,011
Tetraciclina hidroclorica	0,10	0,40
Oxietracicline	0,20	0,45
Clortetracicline	0,15	0,50
Cloramfenicol	7	15
Dihidrostreptomicina	4	13
Neomicina	1	22
Kanamicina	9	28
Becitracina	0,06	0,14
Eithromicina	1	2,25
Rifamicina	0,01	0,14
Diafenilsufona	0,01	0,1
Sulfametazina (sulfadimidina)	0,5	1

1) Бензилпенициллин и бацитрацин выражены в ЕД/мл.

2. Определение

Молоко содержит антибиотики или сульфаниламиды, если цвет питательной среды не изменяется (смотри 7.1).

3. Принцип

Смешивание пробы молока с питательной средой и агаром, содержащим индикатор рН и споры Bacilus stearothermophilus, разновидность - calidolactis, ATCS 10149, культура, которая является очень чувствительной для пенициллина. При росте этой культуры выделяется кислота, которая изменяет цвет индикатора рН, переходящий из красного в желтый. Если молоко содержит ингибирующие вещества для роста тест-культуры, цвет индикатора рН остается красным.

4. Аппаратура и материалы

4.1. Аппаратура

4.1.1.Сушильный шкаф с регулируемой температурой 64⁰С ± 1⁰С.

4.1.2. Водяная баня с регулируемой температурой 64⁰С ± 1⁰С.

4.1.3. Штатив для пробирок или бюксов.

4.1.4. Шприцы с одноразовым наконечником для разлива по 0,1мл.

4.1.5. Пинцет.

4.1.6. Сушильный шкаф для стерилизации отрегулированный на 170-175⁰С.

4.1.7. Автоклав 121⁰С ± 1⁰С.

4.1.8 рН-метр.

4.2 Посуда.

4.2.1 Флаконы, автоматически закрывающиеся для отбора проб.

4.2.2. Чашки Петри.

4.2.3. Флаконы на 250 мл.

4.2.4. Пипетки стеклянные на 1 мл и 10 мл.

4.2.5. Пробирки или бюксы с пробками с внутренним диаметром 8 мм.

4.2.6. Стерилизация стекла (посуды).

Посуда должна быть стерилизована одним из методов:

А) в сушильном шкафу при температуре 170-175⁰С не менее часа;

B) в автоклаве при температуре 121⁰С не менее 20 мин.

После автоклавирования посуду оставляют для просушивания.

5. Питательные среды, тест-культуры

Состав питательных сред должен соответствовать бактериологическим исследованиям. Использованная вода должна быть дистиллированной и не должна содержать ингибирующих веществ.

5.1. Питательные среды.

5.1.1. Питательный агар.

Экстракт дрожжей - 2 г.

Пептон - 5 г.

Мясная вода - 1 г.

NaCl - 5 г.

Агар - 10-15 г.

Вода дистиллированная - 1000 мл.

Приготовление

Растворяют все компоненты в воде, нагревают до кипения, рН доводят, чтобы после стерилизации был 7,4 ± 0,1 при 25⁰С.

Разливают по 10 мл в пробирки или флаконы и скашивают. Стерилизуют 15 мин при 121⁰С.

5.1.2. Среда с агаром

NaCl - 2 г

Агар - 15 г

Вода - 1000 мл

Раствор триметроприма или тетроксоприма - 10 мл

Приготовление

Компоненты кроме триметроприма или тетроксоприма растворяют в воде. Доводят до кипения, взбалтывают. Добавляют триметроприм или тетроксоприм и стерилизуют 15 мин при 121⁰С, рН доводят после стерилизации до 7,0 при темп. 25⁰С.

5.1.3. состав раствора триметроприма или тетроксо-прима:

триметроприм - 5 мг

тетроксоприм - 30 мг

этанол - 96

Вода 1000 мл

Приготовление

Растворяют триметроприм или тетроксоприм в этаноле и доливают воды.

5.1.4. Питательный состав:

Дрожжевой экстракт - 0,75 мг

Глюкоза - 5 мг

Крахмал - 8 мг

Бромкрезол пурпурный - 0,025

Вода - 50 мл

Приготовление

Все компоненты растворяют в воде, нагревают, если есть необходимость, фильтруют и стерилизуют. Питательная смесь продается в различной форме.

5.2. Стандартные формы пенициллина

5.2.1. В стерильном флаконе готовят раствор пенициллина 60 мг (100 ЕД/мл). Растворяют 6 мг бензилпенициллина в 100 мл дистиллированной воды.

5.2.2. Готовят рабочую концентрацию пенициллина: вносят 1,25 мл раствора пенициллина в дистиллированную воду и доводят до 1000 мл. Раствор содержит 0,075 мг пенициллина 1 мл (=0,125 Ед/мл)

5.2.3. Готовят 75 мл стандартного раствора пенициллина, содержащего 0,004 мкг/мл/ 0,067 Ед/мл, добавляют 4 мл рабочего раствора пенициллина на 71 мл молока (не содержащего ингибирующих веществ) и перемешивают.

5.2.4. Раствор пенициллина из пп. 5.2.1, 5.2.2 и 5.2.3 должен использоваться в день приготовления.

5.3. Молоко, не содержащее ингибирующих веществ.

Готовят контрольную пробу молока с дистиллированной водой стерильной. Для контрольных проб используют сухое обезжиренное молоко или свежее молоко, проверенное на содержание ингибирующих веществ.

5.4. Тест-культуры

5.4.1. Bacilus stearothermophilus, разновидность - calidolactis, ATCS 10149-, используют как тест-культуру штамм 10149, идентичную штамму с 953.

5.4.2. Готовят резервную культуру из рабочей культуры для консервации на скашенном агаре. Рабочую культуру высевают в пробирки со скашенным агаром и выращивают при 63⁰С 48 часов. После инкубации пробирку герметично закрывают и хранят в холодильнике при 5⁰С несколько месяцев.

5.5. Рабочая культура

5.5.2. Выращенную культуру на скашенном агаре смывают 5 мл стерильной дистиллированной воды. Суспензию спор консервируют при 5⁰С и используют в следующие 36 часов.

5.5.3. Стерильной пипеткой вносят 0,5 мл суспензии в чашку Петри с агаром и равномерно распределяют по всей поверхности чашки. Инкубируют при 63⁰С 16-18 часов.

5.5.4. С чашки Петри, содержащей культуру по п. 5.5.3, смывают 10 мл дистиллированной воды. Суспензию переносят во флаконы с 250 мл дистиллированной воды. Закрывают и хорошо встряхивают. Если культура не используется тут же, хранят в холодильнике при 0-6⁰С.

5.5.5. Взвесь спор, выращенная при 63⁰С в течение 16-18 часов без триметроприма по п. 5.2.1, должна содержать 5-10 млн. микроорганизмов. Взвесь спор должна быть равномерной по мутности и не содержать хлопья.

5.6. Приготовление пробирок для исследования.

5.6.1. Расплавляют агар и охлаждают до 55⁰С.

5.6.2. Засевают споры на 5 частей среды в пробирку или флаконы и перемешивают.

5.6.3. Перемешивают в стерильную пробирку 0,3 мл засеянного агара, чтобы получить слой в 5 мм толщины и закрывают.

Пробирки оставляют в строго вертикальном положении 12 часов.

5.6.4. Пробирки могут быть использованы сразу или можно хранить при температуре 0-6⁰С.

6. Ход определения

6.1. Пробы должны быть исследованы как можно быстрее после отбора, можно в течение 24 часов. Если невозможно исследовать пробы в течение 24 часов, их замораживают при - 30⁰С, - 15⁰С, чтобы уменьшить инактивацию пенициллина.

6.2. Идентифицируют каждую пробирку, ставят в штатив.

6.3. Добавляют 50 мл из питательной смеси в каждую пробирку.

6.4. Перемешивают пробу молока и переносят по 0,1 мл в идентифицированные пробирки. При каждой пробе меняют наконечник.

6.5. Как описано в п. 6.4, готовят 2 пробирки с контрольными растворами пенициллина, которые содержат 0,004 мг/мл (0.0067 UI) пенициллина.

6.6. Как описано в п. 6.4, готовят 2 пробирки с молоком без ингибирующих веществ.

6.7. Закрывают пробками и ставят в штатив с идентифицированными пробками. Штатив ставят на водяную баню при 63⁰С на 2,5 часа.

6.8. По истечении времени вынимают штатив из водяной бани.

6.9. Читают цвет питательной среды.

7. Учет результатов

7.1. Если цвет среды в пробирках с раствором пенициллина или молоком пурпурный, это означает присутствие антибиотиков или сульфаниламидов "положительно"

7.2. Если цвет среды частично пурпурный в пробирках с молоком, это указывает на содержание ингибирующих веществ (табл. 1)

7.3. Желтый цвет в пробирках с контролем (молоком) указывает на отсутствие ингибирующих веществ.

7.4. Если все пробирки, участвовавшие в анализе и контроле, пурпурного цвета, это показывает, что пробирки не содержат живых спор и надо повторить анализ.

8. Подтверждение результатов

Результаты, учтенные в пп. 7.1 и 7.2, подтверждаются методом В.

Если надо хранить пробы для подтверждения методом В, их замораживают.

МЕТОД В.

ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ПРИСУТСТВИЯ ПЕНИЦИЛЛИНА
И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЕГО КОНЦЕНТРАЦИИ

1. Область распространения

Настоящая санитарно-ветеринарная норма описывает метод определения концентрации пенициллина в пробах молока (по А. 7.1, А. 7.2).

Чувствительность метода к разным антибиотикам приведена в таблице А1.

2. Определение

2.1. Исследуемая проба молока содержит антибиотики, в т. ч. сульфаниламиды, если есть зона задержки не менее 2 мм вокруг дисков.

2.2. Если проба содержит антибиотики, в. т. ч. сульфаниламиды 2.1, к ней добавляют пенициллиназу (беталактамаза), и если не происходит задержки роста, нет зоны, или зона задержки роста менее, чем следует, ингибирующим веществом является пенициллин или пенициллин с другим антибиотиком, в т. ч. сульфаниламидами.

2.3. Если зона не инактивирована пенициллиназой, пенициллин не является ингибирующим веществом, это может быть другой продукт.

3. Принцип

Диски из фильтровальной бумаги пропитывают пробой молока и раскладывают стерильным пинцетом на питательном агаре со штаммом Bacillus stearothermophilus. Зона задержки роста этих микроорганизмов вокруг дисков означает присутствие в молоке ингибирующих веществ.

4. Аппаратура, посуда, материалы

4.1. Аппаратура

4.1.2. Баня водяная при темп. 80 ⁰С ± 1⁰С

4.2. Посуда - смотри А. 4.2

4.3. Диски из фильтровальной бумаги, не содержащие ингибирующих веществ, диаметром 9-13 мм.

5. Питательные среды, стандартные растворы, раствор пенициллиназы, реактивы, тест-культуры и др.

5.1. Питательные среды

5.1.1. Питательный агар (по п. А 5.1.1.).

5.1.2. Среда для анализа ингибирующих в-в.

Состав:

Дрожжевой экстракт - 2,5 г

Триптон -5г

Глюкоза - 1 г.

Раствор триметроприма или тетроксоприма (А 5.1.3) - 10 мл.

Агар-агар -10-15 г

Вода -1000 мл

Приготовление

Растворяют в воде все компоненты, нагревая (кроме триметроприма). После добавления триметроприма доводят pН так, чтобы после стерилизации pН был 8,0 \xf10,1 при 25⁰С^.

Стерилизуют 15 мин при 121⁰ С ± 1С⁰

5.2. Стандартные растворы пенициллина в молоке по п. А и п. 5.2

Для контаминации ингибирующих веществ готовят стандартные растворы пенициллина в молоке, свободном от ингибирующих веществ, в следующих концентрациях:

a) 0,004 мкг/мл (0,0067 ед/мл)

b) 0,006 мкг/мл (0,01 ед/мл)

c) 0,03 мкг/мл (0,05 ед /мл)

d) 0,06 мкг/мл (0,1 ед/мл).

5.3 Раствор пенициллиназы

5.3.1. Растворяют достаточное количество пенициллиназы (беталактазы) в дистиллированной стерильной воде, чтобы получить концентрацию 1000ед/мл. Этот раствор в маленьких количествах хранится при температуре 0-5⁰С максимум 4 недели.

Примечание: пенициллиназа не была стандартизирована интернационально. В данной методике подразумевается, что 10 ед. пенициллиназы инактивируют 0,6 мг (1 ед. пенициллина). Если неизвестна концентрация пенициллиназы, проверяется по инактивации пенициллина.

5.3.2. Вместо раствора пенициллиназы можно использовать пенициллиназные диски.

5.4. Тест-культура по А п. 5.4.

5.5. Споровая суспензия по А п. 5.5.

5.6. Подготовка чашек Петри.

5.6.1. Среду расплавляют и охлаждают до 55^oС.

5.6.2. Во флакон смешивается часть споровой суспензии (п. 5.5) и несколько частей среды, чтобы получить соответствующую плотность в засеянной среде.

5.6.3. Разливают в нагретую до 55⁰С чашку Петри засеянную среду толщиной 0,6-0,8 мм.

5.6.4. Чашки Петри раскладывают на холодной горизонтальной поверхности. Поверхность измеряют нивелиром. После охлаждения чашек их переворачивают. Чашки должны быть использованы в тот же день или в течение 2 недель при хранении при температуре 5⁰С в полиэтиленовых пакетах.

5.6.6. Идентификацию проб производят на дне чашек.

6. Проведение анализа

6.1 Приготовление проб.

6.1.1. При положительном или сомнительном результате производят новую идентификацию и каунтификацию пенициллина по методу А (А. 7.1 и А 7.2).

6.1.2. Предварительно подогревают пробу молока при 80 ± 1С⁰ для предотвращения воздействия термостатических средств.

6.1.3. Перемешивают, затем переносят 10 мл подогретой пробы во флакон с удлиненным горлом. Добавляют 0,4 мл пенициллина (5.3).

6.2. Выявление ингибирующих средств.

6.2.1. Чистым пинцетом обмакивают в молоко (6.1.1) бумажный диск (4.3). Избыток молока удаляют с помощью бумаги о край флакона. Накладывают на среду в чашку Петри (5.6).

6.2.2. Диски, пропитанные молоком, накладывают на среду на расстоянии 20 мм друг от друга и 10 мм от краев чашки.

6.2.3. Для контроля проведения метода накладывают диски (4.3). Пропитанная пенициллином этанолом (5.2. а) в разных местах между дисками с пробами в пропорции минимум 2% из числа дисков с пробами; пять эталонных дисков используют при каждом тесте.

6.2.4. После идентификации и накладывания дисков перевернутые вверх дном чашки инкубируют при 63+ 1⁰С от 2,2 до 5 часов.

6.2.5. По прошествии этого времени чашки анализируют при хорошем освещении для обнаружения задержки зоны роста, изолируют эти зоны.

6.2.6. Эталон пенициллина (6.2.3) должен иметь зону задержки не менее 2 мм.

6.2.7. Обнаружение зон задержки роста вокруг дисков с пробами соответствующих размеров (6.2.6) доказывает присутствие ингибирующих средств в тестированном микроорганизме.

6.3. Идентификация и каунтификация ингибирующих средств.

6.3.1. Описание деталей в 6.2.1 делают попарно с нагретой пробой молока (6.2.1), а также с пробой, пропитанной пенициллином (6.1.3).

Вместо того, чтобы добавлять 10 мл пенициллина в пробу, лучше вместить диск, пропитанный пенициллином (5.3.2), в молоко для накладывания на среду в чашку.

6.3.2. Производят операцию 6.2.1 попарно с каждым эталоном раствора пенициллина (5.2 а-d)

6.3.3. Вычисляют среднее число диаметров зон соответственно пробы молока, а также молока, обработанного пенициллином, и эталонных растворов.

7. Обработка результатов (по п. 2)

7.1. Если средний диаметр в видимой зоне вокруг диска, пропитанного молоком и обработанного пенициллином, равен величине среднего диаметра зон вокруг диска, пропитанного молоком, проба молока содержит ингибирующие средства, не поддающиеся инактивации, концентрации пенициллина, используемым по описанному методу.

7.2. Если диаметр средней зоны вокруг диска с питательным молоком и пенициллином меньше средней величины диаметра зоны вокруг диска подогретой пробы молока по 6.1.2, в таком случае молоко содержит сульфаниламиды, или пенициллин, или пенициллин синтетический.

Синтетический пенициллин, или клоксацин, не может быть инактивирован пенициллином, как было описано, они классифицируются как другие ингибирующие средства.

Примечание: другие ингибирующие средства от пенициллина идентифицируются соответствующими процедурами.

8. Определение концентрации пенициллина

8.1. Определение концентрации можно осуществлять или по эталонной кривой, или по расчету зон, достигнутых от эталонного раствора пенициллина в молоке ( 5.2. а - d).

8.2 Разметка эталонной кривой

В связи с тем, что есть соотношение концентраций log 10 пенициллина с диаметром зоны, кривая может быть размещена на полулогарифмовой бумаге, с размещением концентрации пенициллина на ординате и диаметра ингибирующих зон на абсциссе. Вычисление диаметра зоны. Вычисление диаметра ингибирующихся зон произвести из среднего парного числа. Диаметр размещен на графике в зависимости от концентрации эталонных растворов пенициллина.

8.3 Расчет

Концентрацию пенициллина в пробе молока можно пересчитать по диаметрам зон, по регрессивному уравнению или кривой. Для более точной дозы радиус ингибирующей зоны должен быть самое меньшее в 3 раза и самое большее в 5 раз или равен дискам.

9. Оценка результатов

9.1. Оценку производят по концентрации пенициллина, соответствующей или в большем количестве 0,004 мг/мл (или достигнутая концентрация) и для ингибирующих веществ, другие от пенициллина и эквивалентная концентрация пенициллина.

9.2 Повтор (r) и репродуктивность ® цифры могут быть значимыми и незначимыми из-за использования сравнительных эталонов.